培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

  D5 J2 U3 O1 A我的操作步骤：/ `8 O& f; e/ P4 b; R, J$ i
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
# u. A. ~" L! K" _" T! G2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；, K8 i$ f1 L  y8 A
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；* E: f% F8 W+ y8 ^6 a1 n
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；! H- y/ r: L; I1 j; z
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
- J& o0 {9 B* n) ~4 z6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
) Z; R) H. y) @, `, O7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
* Q/ z% v* D! [0 S8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
4 D+ {% N" T' ~* K. n9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。5 g+ M0 k! J6 V7 P. R. f
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***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。
1 V7 y& H5 s5 q! c! h+ E
2 {. N4 m, Z  M9 j+ U0 _我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
) g: @8 G* ]; t附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
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jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。1 z9 t, ^+ R. R0 y! M  O, i- z  v8 y; k
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另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

: R( z1 G2 d1 y: L

# t7 M9 E( U: r+ O3 B  i' V% H回复 cloud100 的帖子' h5 M$ J" [0 F/ H$ m" P: K9 E
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请参照这篇文章的方法试一下：. |+ d- _9 }) q- S1 f3 {

% S5 ]  X7 m& J8 s1 ]0 C$ u; r# O& x: t( c7 B2 G

) A9 V3 V6 q9 F) P" b# y另，推荐阅读：3 T6 ]+ I* A5 C# f5 g) ?/ P& d' l6 M; r
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• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
    G# Q5 x' c  e5 nhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：
  % L2 X8 {& S$ v! s2 J+ P' c% Chttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：" _& D, k6 Y& o: |: a3 g3 [. ^' I
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质胶质的备置：
  $ ?$ |- P8 Z/ \0 \8 Y# v* [http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：5 S  B4 h, j+ X3 J$ |6 W) e
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：2 o4 k" H! c# B% {9 O
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
  ' D9 D6 s! U  J9 l7 s# T1 m; p2 @http://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子, o1 k9 U2 t1 h: n

" L5 p6 z4 d8 j$ B- M! M啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子
3 p) N+ u( w) L8 {" {! c* Y7 ^
好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子
: W1 C) V+ M' F) a8 \; p& [: ?9 Y, p4 G- ~( Q- v# w$ A! ~
好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子! d# t7 f& B& v2 P  s* _# f3 \; Q

7 s$ l4 |# y8 {  N/ \  C我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？