培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

! A; x0 B- Q; p$ P
我的操作步骤：: A  {9 X9 T& Y
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】
" k, A/ _3 b& R: e) L2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；) n7 P6 O# M8 M
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；4 z7 g4 K, l0 w  ~# J, J' y
4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；
+ O0 n; R" b* L; P5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
( r/ r" l8 p5 i' [6 R2 F+ ^& \6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
  V; D9 _7 G2 j+ r" r7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；% n5 ^& O& F0 m1 m1 w
8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；; D6 d* r3 c9 u: m7 W5 b- p0 e. \
9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
; d1 T/ y1 g6 z1 m1 ], e
/ j$ c8 [8 y* E! d6 x5 R6 I, h& K***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。: M' p( U( p: C! p- ~7 e% ?. s
# C& h- R; L, T( k* g- k
我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
3 b( A5 o' @2 @附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
: _( {1 O" i+ [: d' ~) q. d; l# m1 c# p8 L

jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。* ^5 U: I' \' a

. H" Z/ ^$ d; N, t. a另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

, ^: r9 A( u% P/ ^
" P+ G) }! u& v. X
回复 cloud100 的帖子  c. @/ k$ }8 R4 l, I

- p4 G8 Y2 S& O( x% r+ z请参照这篇文章的方法试一下：. O9 i' z* i" l* f; f

2 W0 o! E3 J2 i/ s3 q1 r, V6 ~7 s8 Q, h% _, P" p1 Y0 B

' O& c" O' Q$ u8 w  [另，推荐阅读：
' o, e6 M) ]* v1 I! g% V
( _! h/ N1 m' P5 e; r8 M

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：
  ; H( b2 H4 C! N; Rhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：% `9 V2 x2 f2 Q8 Q6 V8 ~( L
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：
  8 Y2 o6 M* v3 C6 B" k# Xhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质胶质的备置：! v$ w3 r( m9 B1 {) m
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：
  ) X/ _# |- q) A) r; yhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：" M) o! q5 |6 q8 R! b8 g
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?% J+ z$ ]. J& h5 _% w. G
  http://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子
# Z# D3 {; Y" H8 }+ _7 X$ i8 X! P% \5 B1 A, S9 _: l; s
啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子
1 s& p6 Z+ t* D1 f* Y* m' A. o5 Y0 j- y8 j) o9 l4 E
好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子
) t+ u8 p/ @8 z& @3 z/ u. u! r/ l. d  N; f) L
好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子) X- U) I4 y9 M) I- K* E

5 k( T8 I9 i5 ^( i% k$ m" Q; a# F我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？