培养脐带干细胞没有成功，恳请各位老师指教，谢谢您！！

cloud100

3 F" f; u9 f/ Z  I: ]! l
我的操作步骤：( T, ^( E, d' o, M; r1 c
1.手术室无菌剪取的脐带保存在【4℃含200u/ml青霉素,200ug/ml链霉素的DMEM/F12】中，12h之内带回实验室处理；【以下操作均在冰盒上进行：】  y) y2 ]% ~5 Q& Z2 {' j3 t
2.超净台内，选取血管内无明显瘀血的脐带小段约2CM长度，剪取后放入【含双抗的PBS溶液中】冲洗4次，将血管内残留血液洗净，直至PBS无明显颜色变化为止；" Z) Q% u4 v, U# k/ t; V
3.小皿内、在DMEM/F12浸泡下对脐带进行分离，待2根动脉分离完毕后，用持针器撕取位于脐带羊膜和静脉之间的胶状组织；
6 W" x" c/ Y% D: q& }4.用解剖剪将撕取的条索状组织剪碎，呈小颗粒状，大小约1-2立方毫米；& ~) P7 i. A$ W# S0 h( B
5.“NEST”  T25培养瓶用FBS润湿瓶底以后，将小组织块接种到瓶底，约20-25块/瓶；
* ?5 S7 I% s$ V9 ?+ ~6.将接种后培养瓶倒置，放到37℃、5% CO2的培养箱中孵育；
! `; ]' }, U+ i- `7.将倒置的培养瓶分为3批，分别在倒置后18h、20h、22h将瓶子进行翻转（此时组织块周围形成一层膜状液体，有轻微流动性），滴加2.5ml培养液【10% FBS、2mM谷氨酰胺、100u/ml青霉素,100ug/ml链霉素、89% DMEM/F12】，正置、培养箱内继续孵育；
' t/ T; p% A, e9 i0 B8.培养瓶翻转后第6天，培养液呈淡黄色，予以半量换液，添加3ml培养液；
/ Q- h/ `$ x& F7 a* z! _6 D& C9.今天是换液后第4天，（培养后第10天）培养液颜色变化不太明显，呈淡红色，镜下观察无细胞游出，未予换液，打算3天后再行观察换液。
" n6 o. O% i# V3 B" q; s+ Z3 y1 P6 E
***另外，我的FBS--- Giboco；DMEM/F12---HyClone；双抗---Sigma； 谷氨酰胺---Amresco;  PBS---Solarbio粉末自己配的。1 U, [" J7 c6 q- S
2 S5 v! w- p! V0 E6 S/ K
我的问题：这次培养的组织块，贴壁很牢，第一次换液几乎没有组织块脱落，由于组织块较小，几乎呈单细胞层进行贴壁，镜下观察细胞间融合也还好，，但是感觉细胞代谢很慢，培养液颜色变化很少，还是淡红色，第10天还是没有细胞游出来。感觉好迷茫......是我的培养方法有问题吗？我养这个细胞已经3个多月了，一直没有成功，真的要哭死了，恳请各位老师指导！！谢谢了！！
: A9 @# y( h! [+ r) ?附图：今天拍的组织块，第一张10倍，第2张15倍
6 C3 _: e# k% v1 |
& i8 ?' I# p/ M1 p

jianglei_sd

直接将剪碎的组织块转移到T25瓶子，不用FBS润湿。, {. K/ }! A% }( J+ {; E
8 t( {7 a1 F, b& O
另外2,3,4步操作要快，不用剪的太碎，不要在冰上太长时间。

单个核细胞

; G: m6 P% H+ |. K* a5 l, S; m

6 Y0 g* \8 Q& L6 E% q4 Z( {2 b) n回复 cloud100 的帖子
( r1 \+ q1 }9 S% m' e- \9 o* c5 _+ h8 J( m) w- a: P; D' |2 S8 R
请参照这篇文章的方法试一下：4 r( E& L" W! h, ^

! h. l! G  W3 F9 k9 C9 K. _
5 B2 Z3 H5 c! z5 r) H9 O7 c
' r7 C) T! B; P0 A; S( x另，推荐阅读：* {9 k3 N+ m! ]* T3 _% u% }/ {0 `
& h/ N& y5 }' x+ X; o

• 脐带间充质干细胞的贴壁分离方法：! l6 d' R- _' B0 r- F
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 请教华通氏胶的剥离：. N" {2 {5 ^+ u8 N
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 应用怎么样的培养技巧可以获得更完美脐带间充质干细胞：
  4 N9 Y5 O# {6 e# v; Q" Nhttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质胶质的备置：
  : m, R. ^( f; J2 Phttp://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质细胞贴壁法出芽率怎么这么低：9 H, _3 F- G! q! s' ]% A5 P
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 脐带间充质贴壁法到底几天换液：& U# _3 I3 e; \* `
  http://www.stemcell8.cn/forum-vi ... rby%3Ddateline.html
• 各位大虾能把自己养的脐带间充质细胞出来晒晒吗?
  " m- p* G4 W9 I% shttp://www.stemcell8.cn/forum-re ... 79-pid-644496.htmll

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

月_幻影

我与LZ的培养情况有点相似，都是换液的时候很少有组织块掉下来，不过建议LZ再等等，一般我做原代怎么也得两周（14、5天）后才有成片的细胞爬出，还有个人感觉铺瓶的时候不用PBS湿润，直接铺瓶倒置培养4H或过夜后加培养液正置培养即可……祝LZ成功~

frankhu

看了楼主的实验过程，觉得太过于复杂了，脐带间充质贴壁培养相对来说比较简单，取回的拨完脐带，剪成米粒大小，然后均匀平铺在瓶底，加的培养基要浸润组织但不浮起来为准，培养4小时后补加培养基完全浸没组织，继续培养，然后观察到细胞游离出来，培养基颜色变黄后首次换液。接下来就是隔天换液，待瓶子长满后传代。

cloud100

回复 jianglei_sd 的帖子
2 i( i3 d4 ~& _4 d6 F- g) ?
1 i4 f. ~( o/ ~$ g啊，我之前剪得组织块比较大，可能有个3-4mm长吧，后面全部浮起来了。这次我剪得很碎小，只有1-2mm大小。

cloud100

回复 单个核细胞 的帖子
  _! z, i* T; V9 [! {# R  }
2 K, ^3 u' R6 q- ]$ v好的，谢谢您的指点。。。

cloud100

回复 月_幻影 的帖子, X& `7 A7 M, c  e/ U4 D& W' Q  D1 d
# x. i* Y; p/ |) T' Y6 w
好的，谢谢您！！我再等等。

cloud100

回复 frankhu 的帖子3 T6 \  f) K2 t) N4 g2 {3 ]
* o- S' [' ]9 U" P3 _
我之前没有倒置培养，组织块也比这次要大一些，厚一些，但组织块贴壁很松，换液时全掉了，，然后，还想请问您，隔天换液时必须的吗？培养基颜色没有明显变化也要隔天换液吗？