求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊
" R/ w. \# R8 t* ]3 M+ {( Y+ e培养材料：
* [9 o9 y; O( ?无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
' t$ q& Z: l3 Y+ d/ }细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）
# w( B4 x+ Q% W) l" E操作步骤：
; U5 n! u/ J0 P0 i1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
/ O' {& x! \  Z! J' k2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。* `5 O! }- y& h  l4 a( f
3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。' p! _+ ?" a. l# [$ P, b1 J
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。
" P2 s6 A' L# g% M( H5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。/ S) [2 u* u2 Q7 v! |

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子
- D. [+ G: r4 W) _: d+ W8 p/ ?$ P
  L/ G) [% W" }/ Q) w90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子- K; R5 A9 r9 n+ b  h. d
! d1 k# [* @' m( W, m9 X
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子  t% b. X# c5 Q. V, o0 F8 L

8 g, A& S: R& O( e% v+ }* |  U$ E请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子
) ?5 v+ B7 b3 a7 h
0 r' W, L6 G* W9 I) A细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 ' Y7 t" b; }/ |
回复 wind789 的帖子1 I! }+ y6 R9 }" F# T* i0 y/ B
. A; F. @1 C$ I; X6 L6 M, Y8 C
20%左右

! s! q2 {! D  K6 B
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

& B; q- f1 B! b* M) w) I% l$ n& v2 d$ r8 V& ~
回复 yangpan521 的帖子2 r# g$ o, H- |; k* H
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