求指导NK细胞培养

yangpan521

哪位大神帮我看看这NK培养流程有没有不妥的地方，细胞数量上不去，着急啊# \2 E" ]" R  ?% N& ^: S
培养材料：
0 m0 j0 |1 ^( y, G; I2 F+ D2 M0 m无血清培养基GT -T551、生理盐水、淋巴细胞分离液Ficoll、人血白蛋白、自体血浆
* P% b* Z. C: U细胞因子：IL-2（1000IU/ml）、Anti-Human CD3（5ug/ml）、IL-12(500IU/ml）、IL-15(500IU/ml）: V  Y1 [- q2 D7 O
操作步骤：. y4 n. E  p3 {: O& S" t
1、采血机采集外周成分血50ml ，用生理盐水1:1进行稀释，
5 T9 L5 w$ U* ?: I0 a/ u2、由Ficoll液分离，去红细胞，收集初步纯化的单个核细胞：经Ficoll液梯度离心分离单个核细胞，Ficoll液与待分离的单个核细胞悬液比例为3:5分离方法: 取新的50ml离心管，没管加入15mlFicoll分离液，将25ml单核细胞悬液，贴壁轻轻加入管中Ficoll液液面上，注意单个核细胞悬液的加入不能打破离心管中Ficoll液的液面，离心2000rpm/min，20min，升速1，降速0，离心后，液面分为四层，小心吸取第二层的单核细胞层，用无血清GT-T551洗涤2次，离心1800rpm/min，5min，20℃，弃去上清，再用5ml无血清培养液混悬。
+ l* }! e# _0 g9 k% n7 K/ M" ~3、细胞计数：吸取约200ul的细胞悬液与1.5mlEP管内，另取一个新的EP管加入90ul台盼蓝和10ul细胞悬液，用血球计数板进计数。0 g4 w4 D2 f0 M2 O9 L. R6 ]
4、将PBMC密度调整为2X106/ml，转入T75瓶中，培养基加入CD3McAb、IL-2、IL-12、IL-15，并置于培养箱中培养。每隔3d半量换液，并补充相应的细胞因子和自体血浆。6 @8 D, Q* M1 f1 b/ w, I
5、收集悬浮细胞：培养第10d观察NK细胞并收获NK：将培养瓶内细胞悬液转移至50ml的离心管中，1800rpm,离心5min。去上清，用生理盐水再洗细胞2遍，最后将细胞组分混悬在100ml含1%人血清白蛋白注射用生理盐水中，转入细胞回输袋内，制成NK回输液。6 F" T2 p2 Z" N+ J  G0 B( V

pppjjj

大约能扩增多少倍啊？

yangpan521

回复 pppjjj 的帖子1 B/ _0 h+ C  f& S/ Z
" B$ b; Q& _1 [3 y; p$ z
90倍，有的低，都说可以扩大120倍，也不知哪出问题了

wind789

我看文献上类似方法有滋养细胞共育的。另外楼主你10天时,CD3-CD56+细胞的比例大概是多少呢？双阳的细胞大概是多少呢？

gondobar

楼主如果在成本允许的情况下，可以换更高级的培养基，90倍完全可以达到回输要求……

yangpan521

回复 wind789 的帖子2 X4 A$ l+ z: _) D7 a
' t* ?- E5 N2 F0 {" L" T& l
20%左右

yangpan521

回复 gondobar 的帖子& {% |  p/ w  _! W% \

; f) D% x& P  T5 D0 c2 e+ v请问我上面的培养不骤没什么问题吧

gondobar

回复 yangpan521 的帖子6 h3 V# {7 N; m: V7 _# W7 G+ P) L

5 ^3 s/ H" {# N) ~# s' u细胞分离过程和我们不一样，不知道你的方法能得到多少种子细胞。我们大约在5左右（七次方），如果你的方法更多，倒是可以学习一下。

wind789

yangpan521 发表于 2014-8-5 13:24 4 }7 G1 e3 d- g2 E
回复 wind789 的帖子
' Q8 {* [" p% W; o0 M( D1 p: }. _2 {9 W
% i$ ?+ t' F$ r; q20%左右

) F1 i) I! W5 y5 G( d! j
这种比例还算是NK吗？

单个核细胞

8 y) C# {  W0 h) A; _
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' j' K; i/ v- c# [7 S0 F4 v
0 N: k% ~! H2 d/ u8 k5 ]2 h推荐阅读：+ ~; D3 [% c- J7 J, \2 n

/ p* }. Z9 O" V; |9 _5 b% [Expansion, Purification, and Functional Assessment of Human Peripheral Blood NK Cells1 m% l8 @- u: v3 Y1 J% H+ z
http://www.jove.com/video/2540/e ... an-peripheral-blood8 E6 M$ O( _/ P5 G: ]# T
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方案：) N% ?8 _5 r! Y9 K- [( I; {
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物料：