2i培养mESC遇到问题

scottist

最近在尝试用2i培养mESC，结果培养的克隆几乎没有长大，且随着时间推移（3天内），细胞飘起来的越来越多，贴壁的越来越少，不知到时什么原因？还请有经验的前辈指导一下。

splinkerette

回复 genedu 的帖子' ]& o+ o% W7 Q( I6 @4 w5 n
% Y+ f$ e2 i4 W
加血请也可以，好多文章都是配合KOSR0 E2 u/ R. g, u& Q
. I# X" j# Q8 w. d+ d8 @
能不能麻烦分享下相关的文献，谢谢。。我做的完全不加血清的条件也是老长不好，加了血清觉得培养基本质上又成分不明了

scottist

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* W" [- s$ r3 ?4 |- V# i) o
. U. E5 a5 s% P3 T  c: `! v2 j绝对是颠簸不破的至理名言啊。

genedu

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& G, g! Y$ G+ L* D% d
. G* c' w0 }: X- O( _) {% |8 a实践出真知啊

scottist

回复 sylar 的帖子( |* d" }5 Y% @! u" u! [
" b6 @1 O( S8 \8 {# ?9 j3 h
我看论坛上讨论2i的时候很多没说要加血清什么的，尽管文献中说要加N2B27，也没见大家提起，以为不加也可以，谁知道细胞就是养不起来，唉。缺乏常识啊。

sylar

回复 scottist 的帖子* G, k+ H# s6 k; O# L# g

. V: F; V+ u- Z7 J. \。。。你只用DMEM+2i???  血清呢。。

scottist

回复 wbj1983 的帖子9 X2 ?$ U, @+ K, r1 G3 O

, _0 U3 l* }2 u明白了，谢谢！

scottist

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6 {% ]" z) v. G  x( c  z. b3 O& ]  H0 V$ [
谢谢前辈的指导！估计和我没有加N2B27有关，干细胞快速分裂需要一些营养成分，如果只有DMEMF12的话，不能够完全提供，所以干细胞基本不生长，时间长了就出现了大量的凋亡。再次感谢您的帮助！

genedu

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! H# N4 X- E' Q7 o& P5 z/ y+ o
# F9 ?5 ]7 H$ R  e* D8 r问题出在你的培养基上，我一直在用经典的2i培养基培养，成分如下
: m  l$ O: H  z% _6 r9 ^2i Media
0 }" W8 N7 v3 `) i3 ~0 LFor 1L, N2B27 Medium (Ying Q, Nature Biotechnology 2003)  h, K( Z* ^; r# d& H, [

; a8 O( t9 A) K, V$ a& A: h" @* M5 N1.        500 ml of DMEM/F12 supplemented with modified N2 (Invitrogen)
8 `1 @2 _4 Q  S" u2.        500 ml of Neurobasal medium supplemented with B27 (Invitrogen).( p. V& M$ {  a
3.        Pen-Strep (final 50 units-50ug)        5 ml; `" G. ~9 ~- n( o( O3 _/ b, d% m5 X
4.        bME (final, 0.1mM)                        100 ul (1M stock)# [5 u& A, e/ N. K2 H
5.        Lif (final, 1000 units/ml)                8 ml  (1.25x 105 units/ml stock)  |  g3 j7 d5 f* x8 J
6.        PD0325901  (final 1 uM)                0.5 ml (2000x stock)
. X7 V* A3 m2 }: M' J! [- Y/ T7.        CHIR99021 (final 3 uM)                0.5 ml (2000x stock)  C+ h5 |9 ~3 I1 M
8.        Amphotericin B  (optional) 1：100 标准计量看说明书& S; V/ ~+ ^. t" ]' G

wbj1983

回复 scottist 的帖子& X" v0 W; h& B# o7 D- [4 v
! U( B' k' @# ^4 e/ w6 \
ES培养液，把血清换成N2B27再加2i,lif就行了