2i培养mESC遇到问题

scottist

最近在尝试用2i培养mESC，结果培养的克隆几乎没有长大，且随着时间推移（3天内），细胞飘起来的越来越多，贴壁的越来越少，不知到时什么原因？还请有经验的前辈指导一下。

genedu

用2i培养的话，mES的克隆致密化程度会更高，更加立体化，所以看起来显得比较“小”，只要是铺板密度稀一点，培养时间长一点，就可以长大！用2i培养对feeder Cells的杀伤力是比较大的，所以克隆贴壁（feeder）就比较差，悬浮的变多

scottist

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% b/ n8 N  z5 x$ ]1 U# G! B非常感谢您的回复！还想请教您几个问题：如果飘起来比较多的话，是否每次换液时需将上清离心收集漂浮细胞？如果加少量的血清效果是否可以避免大量克隆漂浮？2i培养细胞周期一般要多久？也是每天都换液？我没加beta-巯基乙醇，不知道会不会对培养结果产生显著影响？能否用1-硫代甘油来代替？

genedu

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4 m, A) U. o! D
% {( w( ?+ g* t  |8 L7 R离心上清-消化-中和-离心-铺板；加血请也可以，好多文章都是配合KOSR，因为mES用2i培养体系就是避免血清培养的；2i培养也是一样，看细胞量的多少来换液传代；没加b-Me影响不会很大，因为一般的去氧化剂过段时间后也会失去作用，不过最好是加；1-硫代甘油没用过，不知效果如何

scottist

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/ k2 E. @. v! N' S& n+ e感谢您的指导，学生受益匪浅！

scottist

$ W* R8 {) P6 C; {; U1 {# H9 c' q! }% G+ S$ d
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& n% J1 E" S  S8 ?
; ]+ `' t$ Y% N9 x前辈您好，我最近培养效果依然不是很好，培养第一天，克隆生在还算正常，第三天的时候，贴壁的克隆几乎很少，而且克隆也未见明显增大（见附图），请问除DMEM/F12和2i之外，是否还需要加一些B27等才能维持mESC的正常生长？不知您是否方便传一张2i培养mESC图片，学生作为阳性对照学习一下？谢谢您了！

wbj1983

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& Y5 C1 w0 J; T
ES培养液，把血清换成N2B27再加2i,lif就行了

genedu

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6 l& b5 e6 q! v' M; y8 j& Q& I. R# n, l) T" J
问题出在你的培养基上，我一直在用经典的2i培养基培养，成分如下
/ ]4 E( P1 m* L. Z! p; B/ T2i Media
# q5 R, P" y7 K& ~0 k) ~7 h' S2 D( IFor 1L, N2B27 Medium (Ying Q, Nature Biotechnology 2003)
' A$ `) S, {) Q' k2 j; X
; [2 a, r# `7 [" c$ o8 }1 \1.        500 ml of DMEM/F12 supplemented with modified N2 (Invitrogen)  u, o$ R" g0 V. \* d9 R6 ]
2.        500 ml of Neurobasal medium supplemented with B27 (Invitrogen).
" V# l6 k+ R: }3.        Pen-Strep (final 50 units-50ug)        5 ml
5 n& o" S& x# }9 x( ~2 V, H) S4.        bME (final, 0.1mM)                        100 ul (1M stock)
1 [, ^$ x( M; l9 W+ K+ X8 }5.        Lif (final, 1000 units/ml)                8 ml  (1.25x 105 units/ml stock)
  S6 |  k8 n0 S6.        PD0325901  (final 1 uM)                0.5 ml (2000x stock)) n- t3 Q: j# T9 _1 _) m
7.        CHIR99021 (final 3 uM)                0.5 ml (2000x stock)
* @* M1 ^: T! P8.        Amphotericin B  (optional) 1：100 标准计量看说明书0 ~( i  B4 v$ p# ~, D3 E

scottist

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4 @* k) C' `+ t$ L$ b! P9 l4 F: d+ _' d
谢谢前辈的指导！估计和我没有加N2B27有关，干细胞快速分裂需要一些营养成分，如果只有DMEMF12的话，不能够完全提供，所以干细胞基本不生长，时间长了就出现了大量的凋亡。再次感谢您的帮助！

scottist

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; \6 f6 w2 @* c. w6 |3 j7 I- \6 c4 J# Y4 N
明白了，谢谢！