Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：
& P5 q0 d3 O0 d$ F( ?      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，
& A1 I- U& m2 R- A; u$ Z3 m% i       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃ % }. h; ^$ k+ q8 P& q4 k& k
' V" }% ]4 N; x2 ~
2、反应参数的确定：1 M' N/ X" o, a  q" {
       一般为：94 ℃，10-20S" b0 K) U5 z# F5 Q. `; D1 R) H
                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度2 S4 f# Q7 K3 I. \2 f/ o2 |9 o
                     
4 ~! Y* d1 E, P6 S' ~; u3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值5 O  F% Q3 j6 j% z; x/ z% G, k
       引物浓度：50-900nM
3 i6 c# }+ o6 b+ O       探针浓度：50-250nM7 k5 g9 x5 ?. p

Tlexander

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