请大家来讨论一下四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态变化

宋红卫song

自从实验室引进了OG2转基因鼠之后，小弟从月初到现在最近一直在做iPS诱导。用的Plat-E分别包装pMX-Oct4等四因子，采用脂质体转染法，用6cm皿培养病毒，得到的上清等量感染接种于6cm皿的靶细胞。靶细胞用13.5d的MEF，接种量：1.3X10e5/6cm皿。做pMX-GFP对照，侵染后3-4d有50%以上的细胞带绿光。
4 w# Y4 v- M* P7 s! N问题来了，我发现第二次侵染后的4天里，除了细胞的增殖外，几乎没有看到细胞其他的形态变化。手册上说四因子诱导的细胞在病毒感染后形态会出现变化，出现部分集中形态收缩的细胞；至感染后4d会有类似克隆的细胞聚集！！但我诱导了两次都没有观察到这些变化呀！求有相关经验的同行或大神们指点迷津，究竟四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态会发生怎样的变化？？会有上皮形态的细胞出现吗？我相信这也是诱导重编程过程中的关键阶段，大家来探讨一下吧，帮小弟指点迷津。如果有图的话就更好了！
* S9 K. f& }6 m( A
0 V! O( s- a, s3 Q: {! m* J$ y5 }补充内容 (2014-12-31 20:35):
' a5 T7 s1 A: B! `我用6cm皿培养病毒，得到的上清用其一半感染接种于6cm皿的靶细胞（1.3X10e5）。不知病毒量是否太低

dabai22222

有点怀疑你的病毒titer太低，很简单的方法你可以用四个因子的抗体染一下感染后大概48h的细胞的表达，要确保有足够的病毒感染

宋红卫song

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1 p/ l8 @# K/ u! d: _
' P* m0 i$ J( L: q  K好建议。终于有回复了，谢谢你！

宋红卫song

回复 dabai22222 的帖子9 z' ]& V% _; A- l# c

6 X# Q3 s8 ?1 Q: U/ n在病毒充足的情况下，感染1-5d（还没铺到饲养层，也不是无饲养层培养），这段时间会有细胞聚集或者类克隆出现吗？

sylar.wy

病毒收两次，感染两次，每次24h。9 H0 F) k) C& ?" f

8 }$ Z( Q& A: c5 G主要看你的OG2MEF状态好不好。数克隆可用12孔板做

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子' ]3 X2 L  k5 V4 [7 _& q  C
6 q9 M' Z- H+ v
嗯，谢谢你的回复

陈阳阳

我们做的时候都是用的六孔板诱导的，然后转到铺过feeder的六孔板上。包病毒用的是10厘米dish,包装效率在80%左右。可以浓缩，也可以不浓缩。

陈阳阳

OG2-MEF最好在三代之内，否则效果不好。

宋红卫song

回复 陈阳阳 的帖子- K, ?0 e2 D8 L2 _

! M! c  J  S9 {* t& ^' w嗯，我用的P1或P2。不知道侵染当天的靶细胞密度多少才合适呢？

陈阳阳

我们是6厘米dish,10万个细胞。