请大家来讨论一下四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态变化

宋红卫song

自从实验室引进了OG2转基因鼠之后，小弟从月初到现在最近一直在做iPS诱导。用的Plat-E分别包装pMX-Oct4等四因子，采用脂质体转染法，用6cm皿培养病毒，得到的上清等量感染接种于6cm皿的靶细胞。靶细胞用13.5d的MEF，接种量：1.3X10e5/6cm皿。做pMX-GFP对照，侵染后3-4d有50%以上的细胞带绿光。
% t& Z8 F0 j' w, t问题来了，我发现第二次侵染后的4天里，除了细胞的增殖外，几乎没有看到细胞其他的形态变化。手册上说四因子诱导的细胞在病毒感染后形态会出现变化，出现部分集中形态收缩的细胞；至感染后4d会有类似克隆的细胞聚集！！但我诱导了两次都没有观察到这些变化呀！求有相关经验的同行或大神们指点迷津，究竟四因子诱导小鼠iPS细胞早期靶细胞的形态会发生怎样的变化？？会有上皮形态的细胞出现吗？我相信这也是诱导重编程过程中的关键阶段，大家来探讨一下吧，帮小弟指点迷津。如果有图的话就更好了！
2 W% b: i+ e/ S: P4 x! j
% n. x4 a( s0 {# f8 V9 d& P补充内容 (2014-12-31 20:35):4 G; r2 x* O3 j) e
我用6cm皿培养病毒，得到的上清用其一半感染接种于6cm皿的靶细胞（1.3X10e5）。不知病毒量是否太低

dabai22222

有点怀疑你的病毒titer太低，很简单的方法你可以用四个因子的抗体染一下感染后大概48h的细胞的表达，要确保有足够的病毒感染

宋红卫song

回复 dabai22222 的帖子* u' m4 |" z7 C. G
, x) i! k9 r# \+ W: Y
好建议。终于有回复了，谢谢你！

宋红卫song

回复 dabai22222 的帖子
$ [. S9 C5 t2 W. I9 \1 E. `* K2 A% X* {: {, l/ A# t# [
在病毒充足的情况下，感染1-5d（还没铺到饲养层，也不是无饲养层培养），这段时间会有细胞聚集或者类克隆出现吗？

sylar.wy

病毒收两次，感染两次，每次24h。# H' J7 I' F# W
! G' N" N6 ]( T7 G9 P. W6 o" k# b
主要看你的OG2MEF状态好不好。数克隆可用12孔板做

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子
! z, `# z6 Z& h6 t& t5 y8 L
- h+ Z, E0 e. D- m2 J8 }' R嗯，谢谢你的回复

陈阳阳

我们做的时候都是用的六孔板诱导的，然后转到铺过feeder的六孔板上。包病毒用的是10厘米dish,包装效率在80%左右。可以浓缩，也可以不浓缩。

陈阳阳

OG2-MEF最好在三代之内，否则效果不好。

宋红卫song

回复 陈阳阳 的帖子; Y1 K4 L2 I- y2 @0 o$ n. K+ p/ w& z

; G% |* _( |  Y2 |# B4 H嗯，我用的P1或P2。不知道侵染当天的靶细胞密度多少才合适呢？

陈阳阳

我们是6厘米dish,10万个细胞。