手采集外周血培养CIK疑问！！！

lyj-0017

想咨询关于手采外周血培养CIK细胞的几个问题：
5 _0 Q' \  S! c5 J& {1、采集的外周血是先离心富集血细胞，再用生理盐水稀释后加入淋巴细胞分离液进行分离，还是先把外周血进行稀释再加入淋巴细胞分离液进行分离？这两种方式哪种方式更好一些？: b& j2 t& l0 Z3 g  P- P  K( D% H
2、如果采用经典的培养方式，D0 加IFN-r，D1加anti-CD3和IL-2，D0时往培养瓶中加入PBMC后必须经过2小时或者过夜贴壁，然后把悬浮细胞吸出来之后再加anti-CD3和IL-2吗？, H+ |; v/ w. o
3、如果贴壁后剩下的细胞用来诱导DC，第7天进行DC与CIK混合培养的话，是将所有的DC全部与CIK进行混合培养，还是将DC按一定的比例与CIK进行混合？
( Y' n* p" B! E; [+ L$ T; s
9 ^* h+ O/ t: l9 p" S请大家不吝赐教，谢谢哈~

cjsbaicai

如果之后的离心转速时间等参数相同的话，第一种会多些

lyj-0017

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1 l  k  c1 Z/ p) H# W$ K7 N: O( B! N! E8 {* L% X
第一个问题，我是想知道实验室拿到采集的外周血后，是先将外周血加入离心管直接离心富集外周血里全部的血细胞，富集的血细胞再过淋巴细胞分离液？还是先将外周血用生理盐水稀释，然后再过淋巴细胞分离液？两种方式哪种方式分离得到的单个核细胞会更多？

cjsbaicai

1. 一般来说，培养细胞必须采用血浆，而作为人体治疗，不建议用异体血浆，所以一般是离心后，取血浆作为日常培养基添加物。% I" M2 Y6 I& ^8 a/ x# S
2.关于因子添加，有很多文献报道，但你添加的因子不全，经典方法中少了IL-1α。
% |3 q1 x# W" F, ^: ]3.DC不能扩增，且因操作技术问题，及患者本身问题而导致量不确定；CIK扩增比例大，在临床上很难与DC按一定比例培养，所以常用的方法是，全部混合，一起培养
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lyj-0017

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" U( K8 i5 b5 G4 w2 I你们用的应该是山东威高200ml的单联采血袋吧？采集外周血量100ml？

Ivan0108

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0 n( D7 X' L& k7 R9 d! F. _6 \) `3 Q* o3 I1 ?* @( z' b0 ^' I8 F
我们做这么多年了，28ml枸橼酸钠的采血袋没问题的。外周血2000rpm、10min离心就可以了。当然可以用肝素钠的10ml采血管也没问题，我们都试过。原理上肯定是肝素钠的好些，结合生产成本考虑，我们一直采用的采血袋。方便采集、运输，实验室也容易操作。

lyj-0017

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- i& J5 ]: A; z" u: J
' b  w5 ?% P& w' `4 h0 w1 D3 r自体外周血离心的转速有什么要求？会不会有的患者外周血细胞不能完全离下来呢？再一个，抗凝剂过多会不会影响血细胞富集？

Ivan0108

做自体的可以先离心，得到血清。然后加入生理盐水补足至原血液体积，然后和淋巴分离液1:1比例，2000转/分、20min 慢升慢降可以得到白膜层细胞，多洗几遍一般细胞还好，得率大概在70%左右。  留下来的血清可以后期加入细胞培养中。

lyj-0017

回复 xyz2120091064 的帖子5 Q* G! H- a1 r( u: r! g$ g

7 X2 m8 p# ]" @( R. `% p3 ~6 W自体血浆不是已经离心去除掉了吗？

lyj-0017

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OK，非常感谢！