小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
# @% D: R4 C2 D  v2 `/ f8 h8 A+ k3 y
相应的pMX-GFP对照：. B* p2 h! D- ]

7 Q# B2 r+ J1 f) B& R: `; u' {病毒侵染3d后：8 z% Y: k8 g% T

! S8 h* E: L, A/ p9 L, K到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。
1 w1 t7 u7 o# l$ J1 o第9天细胞形态：0 {/ g$ P+ {! R& J1 Q
' q8 J3 I3 z2 D4 b5 U! x

# t7 M8 d" B6 t' _" f1 O$ K正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。
9 q2 u$ y% |0 {我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。" z( w0 w' \8 L/ T
分析后，发现可能有以下原因：3 z6 \- T- ^  [' k+ n1 w' [8 |
1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；
. _  j0 [9 u4 s2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；
/ j- u/ P6 w% i" U; e* R3 T" r; ~3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。
# A" ^6 y3 a) B5 b% `4、其他原因。
! i: h. w. A( [/ ^- Z8 R3 \希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
1 f; ~" s. o8 K+ x
0 u3 r7 ]9 p/ C7 a( ?, s8 k补充内容 (2015-2-6 16:45):3 c- f5 X0 w+ d4 K% a+ K
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

回复 宋红卫song 的帖子3 i) w- v, J9 O+ T) _9 [, o3 e
# }* O& ~! F; k9 b8 g! O
从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
& J+ ]. j+ S; E. Q2 o$ D小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧# {2 @5 ?. m3 s  U! g
. L' ]4 T6 x9 Y( L/ [+ t! S
补充内容 (2015-2-10 14:05):" x! Q# z! d- w
第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子
: [; @! Q" H# P3 J
5 f+ Y. c" y4 s+ ?9 w嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

回复 saifast00 的帖子2 X; F9 N" h* ~" P8 q
1 @- W- C3 C! f# T: r
嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子+ ^4 b, B- a9 G- y: A: ]+ W6 }

5 b% `( g9 j) `' u) z1 L嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子
% _8 \% _, V% n, ]  i& `6 x  K
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教