小鼠iPS诱导靶细胞形态变化图，大家帮忙分析下是否正常

宋红卫song

病毒侵染2d后：
* K& j( K9 c8 L* q& T5 {3 S
* f1 |, L$ I* k9 J9 s9 w$ T4 T2 J相应的pMX-GFP对照：
$ O9 }$ c7 X  n+ \! `7 m- h$ d$ M  ?% U9 o; f
病毒侵染3d后：
2 B) x) |8 ~" o" O5 _
5 X  C5 D7 |6 n, N! ?1 K到病毒侵染4d时，将靶细胞接种到饲养层上。
; e% Q' _4 L* P9 B3 a& Z9 i! s第9天细胞形态：$ s' j) f- D8 ^

/ d  L0 ^8 q/ S' F8 i; T
4 {4 w* u) c( f# K' [正常来讲，四因子诱导第9天，应该出现mES样克隆。然而我发现克隆并非长得像典型的ES样，而是呈现不规则形、不够致密、细胞核清晰可见、边缘不清晰等。8 s7 b. R" x3 ?. H
我用的是Oct4-EGFP鼠，第九天没看到绿色荧光。0 m5 d$ k1 J8 i' D8 x2 {. B$ e3 F
分析后，发现可能有以下原因：
2 w- O2 j* Q- S1、病毒量还不够，细胞诱导不充分，发生不完全重编程，类似克隆形状只是因为这些细胞分裂旺盛；# N) R! K; |7 h' E( G: K' q
2、LIF失效。我用的LIF在4°C存放近一年，而有些克隆在边缘才出现核质比高、折射光强的细胞，可能因为LIF失效导致；6 g( K5 [6 |: l: _, b
3、本身小鼠四因子诱导在第九天时并不能观察到典型的ES样克隆，我观察的是正常现象，只需继续培养即可。& I2 }" d4 ^/ `% N& T/ a/ j- X
4、其他原因。
- h; R3 f5 p4 E# g2 o; r5 c% k& \3 Y希望有相关经验的科研工作者为我解答一二，我观察的克隆形态是否正常，如果不正常，其可能的原因是什么？
" C$ ?. W- K4 q+ ~7 O. Y5 R. Y0 q' w7 A! A  m+ n
补充内容 (2015-2-6 16:45):! Q, {! z+ G: w! D* i/ u8 T; p' M
发帖时有些小错误：最后三张图中，前两张是pMX-GFP对照。最后一张是OSKM+miR-200c+miR-302诱导iPS

scottist

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* c% c6 N& _8 }) V+ F+ u  K; t
2 g6 @# `9 q0 i* [从形态来看，你9天诱导后的克隆是非正常的，正常情况的话，9天的克隆应该是很漂亮的圆形克隆，细胞紧密排列，遮光性强，像一个金色的圆盘，周围还可能围绕一圈分化的细胞。个人猜测是你的慢病毒感染效率较低造成的不完全重编程。请确保慢病毒的滴度和活性后，再使用。

saifast00

我觉得9d时候克隆还可以挽救，再过两天看能不能变得致密一些？

sylar.wy

感觉抢救不了。。。第四天细胞才这么少？4因子细胞很多的
: N% D2 v( d7 t( Y* B小鼠做ips中途不用传到FEEDER也行吧+ C/ j. r8 V+ `, |# W* ?& D
% M( R8 D4 M1 l
补充内容 (2015-2-10 14:05):
2 Z2 s. {+ T- ^$ X& U% ]% x第九天- -

宋红卫song

回复 scottist 的帖子  z9 y* H& i  B, l# ?

2 ^( h0 \/ O# k, L2 @' q' \. J$ O嗯，感谢您的建议！

宋红卫song

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# g, U6 j$ X, @* m, m
! H  w; O; H. \4 Z! v嗯，目前正在观察。后来发现细胞间隙和细胞上附着很多黑点，有的地方还很密集，怀疑是支原体。不知您是否也遇到过类似的情况？

宋红卫song

回复 sylar.wy 的帖子
, b- h& Q* w4 S- ?
* J4 ^0 k; g* F5 h# C6 @3 J嗯，也有不转导feeder上的。下次分出一皿尝试一下

saifast00

回复 宋红卫song 的帖子4 r8 |6 R5 S' _# `3 D
" d5 m1 ?1 u) o1 ]: s/ B. \
支原体如果不是非常严重理论上肉眼是不可见的，而且如果你们实验室不是常做原代培养，污染支原体的几率也不大

cloudycity

直接不用feeder也可以吧。你的估计是病毒滴度不够，效率不够高。

琴心杜若

本人新手，前辈进展如何？跪求指教