鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）
& U3 `2 R* e% `# i; [; F/ C1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
+ M0 v+ y/ g% p$ i$ K! M2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。4 M& J# R* R4 y' i
3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
3 b1 `1 F1 d* ^1 L% a4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）5 {& v) `4 ~, r* F6 ]) H, P, F" G
5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。
% N2 M9 c. k% r* ?  E- v. D6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。) d  r5 i' M0 I1 G. s1 ?* ~& a* F9 `
$ j7 y8 x2 W; n& g
（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）
- ~/ p5 h% O+ N% u" K1 n' m3 t+ NSSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗7 I4 U4 R2 G$ y6 F

0 k, q# W+ T0 U" t所需溶液：
/ x! {& k0 \' \; K1 e4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
- w" V7 m" ~% Y- ]4 X
5 }4 M8 C: Q* v, d问题向导 ：
' f7 E# G- Q  x: k•  染色过深：
5 H+ {, g3 w1 c( R# L⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。
- [1 u: n( i, Q•  非特异性背景着色：1 B3 Z# ^# f9 ~& b& Z( [
⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；* p) J* y8 Q! N& h
⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
4 F' k( z; G, k' K4 Y0 q•  染色过浅 ：
4 L) L: u' N( p8 `, p⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；