鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）5 k& m- {" i" [# Z- U# \9 `
1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
$ z  b) m9 S2 S$ o' {2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
) ?. K, h# a" v( \. C3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
; l+ p; r0 u, Y+ @4 b/ H! n4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）
% q' J9 `8 ?; x. V$ s# ^  h5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。7 R( o5 i2 h* B/ W8 p
6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。' m0 {6 O' k, d: K/ h- X
( j/ U( S! `) f
（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）1 M. m$ v8 k* q$ f7 B" U
SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗1 p! J' [% I' ]+ A

% b& I# o& ?% Z# d  {所需溶液：- T6 s7 [( X' Q* Q6 J
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS! ~9 \5 `/ q0 t8 u+ T" G1 H1 \6 v

/ q6 I( W7 H; t4 b  F2 T' c问题向导 ：
) P/ u  z" b  c7 p1 K. L! a' S% Q* H0 a•  染色过深：
8 _6 K, Z; D: o3 K8 h⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。+ l! f4 S8 y. S. z. |
•  非特异性背景着色：
" }  G; X1 v# B- F* B. b⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；
9 H- @4 Y- j6 z/ n0 P⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。  ^7 p( n# o8 c/ Z1 I* H
•  染色过浅 ：6 Y  z7 d( l# `0 D, t0 O
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；