鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）
! N7 s" C8 ]$ P9 D, O: ~6 G1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
8 v" ~* ?  O6 ]4 `6 F8 j, ^0 v2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
' {9 Y' Z& n" m; q- Y3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
: z. n" d' o: T9 L9 ?1 O4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）
$ w' ~$ ]; t5 {8 C! Z1 P5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。9 C' B5 u' b  D0 W) b9 @: w2 n
6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。6 B6 u" N# d( k

% S% N- B* k' w! J( R9 I（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）3 y: \7 b' r  L: s$ q* {
SSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗
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& E/ y; E+ C$ a2 `所需溶液：) ^: S  z+ E3 q! T' D' Z
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
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问题向导 ：
, Q# U  f8 T+ U. d; c/ c+ [8 L& v7 F•  染色过深： ' ]% u7 A* A& n- F! _, p
⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。
4 X* W$ c- T+ h•  非特异性背景着色：
. u( l3 f2 M! d, {% U⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；
# U) T+ d$ g1 h4 u0 \2 E6 I⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。6 \9 U5 _- p$ ~- P, ]
•  染色过浅 ：
" q! L- o, m/ ~6 C2 i/ _⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；