鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）
* W/ `; a+ n- S' Q, z& T1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。
% l5 L6 w: W! ~$ w0 ?3 h" c2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。
$ R8 r; z" S4 h; P5 Z3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。
8 x4 Z" C: t' `7 h+ @4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）+ Z: Q6 g) `% U9 h7 P- ~/ J$ u
5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。
8 a% g/ x/ J2 @# E6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。6 D7 W5 M2 D7 u+ d1 t7 M1 ?
. T, _9 Q. _* a- |( M/ B
（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）
* C4 |2 M) t0 m2 }* W' c: Z: YSSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗; h2 N$ C1 B3 m, S5 Y
$ A- p9 a0 H) {. c/ O) v: C4 D
所需溶液：3 c  Y, D' `0 E. a! m, s) d5 E7 i
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
5 T, f# Q; G1 _( [" A; l, h% L% ]4 ]3 N$ S. R, w6 {
问题向导 ：
4 _0 U6 c9 R2 o6 u, t•  染色过深： % r& [5 ]8 _- x2 M1 t0 `# ^
⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。# a  _3 q2 v# R$ z% s7 M% G% i
•  非特异性背景着色：
8 D9 F& Q5 ~( ~, ~( ~⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；
" R3 y% s5 Y2 o$ _& r+ ^⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
* q$ W7 @" T# p( ?% y! d•  染色过浅 ：# m  v/ q/ d! ?& ~
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；