鸡精原干细胞的免疫组化染色（培养板中染色）

梦茹

免疫组化染色（培养板中染色）- Y4 \  J$ A1 v. q6 A
1 培养的干细胞集落，弃去培养基，冷的PBS洗两次，首先用4%多聚甲醛（4孔板200μl）固定10min，PBS洗2次，每次5－10分钟。* C. {6 H. T6 N9 h& G
2 在含0.1% Triton X-100（4孔板200μl）的PBS中进行10min的透膜处理，PBS洗2次，每次5-10分钟。手动轻轻晃动数次，吸尽液体。" j' E( I* l  f5 D9 n
3羊血清用PBS配制成4％羊血清封闭液，室温封闭（4孔板200μl）30分钟。: E' u4 I$ F& f5 n) c
4用封闭液稀释一抗到工作浓度（1：20），去封闭液，勿洗，添加一抗（4孔板50μl），于37℃条件下孵育1h或放在4℃冰箱过夜，PBS洗3次，每次5-10分钟。（同时设一孔不添加一抗作对照）5 f6 e' W; a0 n( n( @  v) c
5去掉一抗后，细胞用PBS洗三次。同时用PBS稀释二抗（1：200），然后加入相对应的孔（4孔板200μl），在室温条件下作用30-60min。PBS洗3次，每次5-10分钟，最后留少量PBS。同时采用不添加一抗，而仅添加二抗的细胞作为阴性对照组，检测二抗的非特异性结合能力。# X( A" t* f) @& @0 A3 A
6免疫标记过的细胞通过荧光显微镜进行检测拍照。5 i2 l/ h% ~, }- A

  l! Z! E# E! w, W8 m7 C（可最后添加10μg/ml的PI染细胞核5分钟，PBS洗2次）
. w* A9 g, p1 ~. {* ]+ n8 RSSEA-1, TRA-1-60，TRA-1-81为IgM ；SSEA-4为IgG，注意添加相应二抗$ Q7 c) ?+ U9 i# T8 J/ k, N0 f

, p! p6 F( E/ J% I- p  v所需溶液：/ Y1 a* }* h2 g, G+ v
4%多聚甲醛、0.1% Triton X-100/PBS、4％羊血清封闭液/ PBS
" s) j  @  E. N) {6 l
" Q% F+ p% T5 b, k9 e问题向导 ：
0 g$ d' [; w" I2 |" N: U( H•  染色过深：
) U4 P% w( e/ {" D1 X+ t⑴ 一抗浓度过高或孵育时间太长； ⑵ 孵育温度过高。2 j2 w$ @' O, C( @2 w$ e
•  非特异性背景着色：# S5 Y; _9 i0 e3 t
⑴ 缓冲液冲洗不充分； ⑵ 操作过程中组织切片干片； ⑶ 操作过程中组织发生折叠；
2 T" R6 ?8 p3 }, b) u/ j# w⑷ 组织中包含内源性的过氧化物酶； ⑸ 抗原扩散； ⑹ 多余的组织粘附在组织切片上； ⑺ 蛋白阻断剂阻断不充分。
' [9 S8 r# @* {! j•  染色过浅 ：  w4 R" Y# W5 b" e
⑴ 一抗浓度太低或孵育时间太短； ⑵ 试剂已经降解； ⑶ 操作过程中缓冲液冲洗后残留过多，导致试剂被稀释； ⑷ 复染或封片剂不相配，色素反应产物被溶解；