分离单核细胞时，如何吸取白膜层？

lxy07

如题，请问Ficoll分离全血单核细胞时，首先，如何才能准确吸取到白膜层，其次，我们用的是国产分离液，离心后试管内没有形成明显的白膜层，白膜层和分离液层界限不明显，这种情况应该如何改善？

wanglinling

是用50ml离心管梯度的吗？白膜层应该是比较明显的，可以用1ml枪头触及分离液与上层交接处的白膜层直接吸，一般7ml左右可以完全吸干净。如果没有明显的白膜层考虑1，单核细胞数量偏少。2，梯度的时候操作不当导致分界层模糊。3，降速太快扰乱了本来界限清楚的白膜层。

wanglinling

如果是上面的某种原因导致的可以改善的方法：1，梯度液应在室温18-25°使用。2，铺梯度的时候尽量放液慢，可以倾斜离心管。3，离心结束的降速调低。

cloudycity

1.首先确定你的血样和ficoll是同一种属的吧。不同种属血样的密度不同，ficoll的密度也不同，分离效果也不一样的。5 R+ [2 p8 U( ~0 y4 W  N0 X, n
2.国产的，应该也可以，以前我都使用tbd的，效果比一些进口的还好···如果不行就换其他牌子，还有，离心的时候，一定要无阻力降速，就是把降速调低，以免降速的时候，又把血荡混了。& v+ }$ j7 ^" u$ D' T& O9 I# c2 X
3.你的血样来源？你的血样有多少？血样是否新鲜？是不是太稀了？不新鲜的血，有凝块也分不好，比较好的就是血加上去后，自然沉降时红细胞是像细雪一样的均匀，很漂亮的，而不要有凝块。基本上全血1：1用pbs稀释，然后50mL离心管内含15ml ficoll 再加30ml稀释过的血液，1800rpm 20min升降速都调低，应该都会很明显的。外周血会好分一点，脐血的话可以用羟乙基淀粉先沉降红细胞1-2h，然后取上清再分。
; R$ e! d- J& a' \% I6 z4.如果实在不行，你就估摸着，50ml离心管，白膜大概就在15ml刻度的位置，你把上下2.5ml刻度的液体都吸了。

lxy07

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" F" Y" |: y; J; B& W
  N: U5 N0 F3 M! w" m% o* v- X0 [/ u是50ml离心管，降速已经调低了。

wanglinling

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! Q4 t5 d; P# @' [, j8 B) m# ]; u$ {" ^( O+ k
那你应该观察一下刚铺好梯度的时候分层是否明显，可以看出你铺的好不好

lxy07

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7 K% a' J) X) ^) z2 B) m* _' R' `8 t! ^% M9 j
1、是人的，Ficoll也是分离人的。
% Z+ X2 o, x- R; e2、我们用的也是TBD的，降速已经调低了。
& p9 `. @& |. L( ?  u+ b' V  `3、脐血，75ml，血样算新鲜的，没有凝块。% I1 G! L# W3 K6 q4 U
4、我看有的帖子上说，取白膜层的时候要蹲着平视离心管操作，这样做是不是能更好的吸到白膜层。

lxy07

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8 A; ^2 B  V" z! v' Z  ]$ ?7 I- I( x2 r+ ?7 x" E! P. g
你是说血加上去以后吗？刚铺好不久后，就像cloudycity说的，血自然沉降像细雪一样降下来，但没有看到分层啊。

维维睡啦

1、先检查一下你们的FICOLL是否为MNC专用，其密度是否符合标准,为1.077±0.001。! d- n( L- u# u0 s! A3 ^
2、全血加FICOLL之前要去血浆，稀释的。3 D' A' B) M: X  ?0 r  U
3、加FICOLL时要小心仔细，使FICOLL和血细胞有明显分层。! e5 ~- ^9 H2 s- T: H: c6 |
4、FICOLL离心时，升降速都要调低，一般为升6降4就可以。
) E' s3 Z5 d& D2 ~5 }5、离心后即使没有明显白膜层，也会有明显的三个分层，上层为生理盐水和血浆混合，中层FICOLL层，下层血细胞。白膜层就在中层FICOLL层中，即使没有明显分层，绝大多数单个核细胞也是在这一层中，如果没有明显分层，可以把这一层液体全部吸出来，再离心获取单个核细胞。! T" L9 R3 K' T

lxy07

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! t* h: L. i& K8 z
, b- v+ j& }5 @1、Ficoll是MNC专用，密度是1.077。
2 g. Q/ f: d5 w2、去血浆，稀释了。; o' }2 W/ d: [, y
3、FICOLL和血细胞有明显分层。: D+ q  z" ?, N! Z2 S( W
4、升降速调低了。( {; i1 X4 ~) B+ a+ n- O
5、离心后有明显的三层，如果将中间层的液体全部吸出来，会使混的红细胞和血小板等杂细胞较多，有的人主张白膜层以下、红细胞层以上的这一层要保持在1公分以上，是否有必要。