CIK细胞鲎试验（内毒素）检测

fsj1987

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fsj1987

我先来踩点
) R6 G* E3 o0 o6 ?1、实验室物品准的准备7 o7 k5 ^. d7 r; Q6 v* Z
1.1        涡旋混匀器。
5 M* {* z% R- Q1.2        恒温水浴锅。
% U( l1 k  H! C/ J1.3        鲎试剂（TAL）。
( X) i+ _. |) A+ E; x, C& f1.4        细菌内毒素工作品（CSE）。
1 @( d# r7 J/ [. `( x1.5        细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。
1 k7 O, v- F( y) D1.6        无热原试管。
1 M% z! `7 F* T, K1.7        无热原吸头（200ul，1000ul）。
  Z, K& W8 ?4 Z3 d5 B2、内毒素标准工作品溶液的配置6 B9 ?6 ^# Z& c
2.1内毒素标准品溶液的配置$ I7 ^0 D9 q% E; y- p# r) b! {0 E
取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。
6 L" i3 h2 P* T- S8 q内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）
) P9 p# Q' _+ ?  |# X10EU/ml    1.0EU/ml     0.50EU/ml     0.25EU/ml2 n  v5 S& O* g1 u- b
2.2 供试品溶液的制备
& Y% K% ~1 {9 ?$ @9 t# f# c有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：
9 b* }- f+ ?; V( uMVD=cl/λ
+ X4 M: A: \6 I- W+ E0 K, r& \式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。4 x; n. b- R* R  e) T( R
如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。
& |8 D8 x: J4 m" j1 J0 _) f  S. yMVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）
' p$ f% b( B3 v+ g+ j取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。) \3 L3 |; O1 v. b! B: e0 S
2.3 供试品阳性对照液的制备
1 g) a: R. c9 s5 `% R分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。
$ C" `  W$ v" Z8 ~3 ^( R8 y2.4 鲎试剂的准备
1 V2 t6 u! H/ v) Y9 g# r1 d5 h+ p6 K9 X根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。! M# Y7 j; e/ M! d
试验加样见下表1。
. G# {7 q1 x* Z0 }- u表1供试品内毒素检查加样方法1 X1 M" z) \) z' D

+ O  u$ ^# U2 P# p/ Y
  r: G7 t0 L4 E7 N测试组（A）        阴性对照        供阳组（B）        阳性对照- H  c) r0 a% t! b
        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号,2号% U! Y4 C  c( @/ Z' J3 g& I
鲎试剂溶液        0.1        0.1        0.1        0.1
7 B3 R. d7 i* ]0 E! K5 |, }标本液        0.1                       
' _2 R( M# G/ [检查用水                0.1               
* E( H& l. U4 A: X供阳性液                        0.1        5 C* S" @6 U/ T4 ]: i0 e
阳性对照液                                0.1
3 |7 |" }5 G. c3 V2.5 检测7 a0 G2 c( n/ n$ D
加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。
: M( C* k0 H4 q& d8 x判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。: b, Z/ H* {- @

fsj1987

今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？

teahouse0802

我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。: Q$ y7 `1 K# ~" w7 V4 @$ N) ~, A
4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。7 J9 o  W' i, t! {$ }" Q. B
如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。) Q+ S  y2 r# ]4 f+ D& P" {
如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。

teahouse0802

回复 teahouse0802 的帖子/ w* B/ ?) S) i

: m$ w  U9 E6 p补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。

colins

回复 fsj1987 的帖子2 A& F2 x0 ?: v5 ?; x2 N; K3 y

& G. Y3 |2 g7 F( S如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。
$ _4 Y: a6 S5 _0 ?1 N, R4 Q3 [  W我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了

yingfeixiang

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4 l. v: ^+ O0 N) R& A8 Q& {$ c5 O  V# K+ `' P
是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次

baby00000003

有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器3 w7 l/ j8 a& s! j7 `
通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量

免疫与细胞

我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。

细胞海洋

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