CIK细胞鲎试验（内毒素）检测

fsj1987

大家hi起来讨论一下鲎试验吧！自己提高也能服务新人

fsj1987

我先来踩点
( I: R- v1 ]; V3 x, V1、实验室物品准的准备
' B1 \& m7 j9 P; f* |4 Z0 X$ Q) ?1.1        涡旋混匀器。- C- I/ v* v8 M& O* H* B
1.2        恒温水浴锅。
/ _) r5 M: S& i' x1.3        鲎试剂（TAL）。* [& b- M# W' Q( J( v; R; s
1.4        细菌内毒素工作品（CSE）。5 h# {9 c8 E% V& U
1.5        细菌内毒素检查用水（BET），内毒素含量<0.015EU/ml。; n: _" K" H. o, w# X8 v
1.6        无热原试管。
- \" b. Z5 F9 k# k+ v# G! h9 X' _1.7        无热原吸头（200ul，1000ul）。0 }, C) X+ o$ s0 H2 z- c
2、内毒素标准工作品溶液的配置
) e3 T, j0 H1 f* X- \* L; u2.1内毒素标准品溶液的配置
) n' v1 T( e6 F4 J2 z) J) y取细菌内毒素标准品1支，用酒精棉球消毒瓶颈，开启加检查用水1.0ml并混合15min备用。
2 T3 A) V9 E& a内毒素标准品为10EU/支，鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml时，内毒素阳性对照稀释至2λ，即0.25EU/ml。（注：横线上方表示取浓内毒素溶液的量，横线下方表示加检查用水的量。）" ~( n0 I& p7 D% v' v- Y
10EU/ml    1.0EU/ml     0.50EU/ml     0.25EU/ml9 j$ E: e( k6 R! C( x
2.2 供试品溶液的制备 0 {- J, W, s; A2 F% Z, ?) [
有效稀释倍数（MVD），按下公式计算：
1 X2 O7 K% a& k/ `7 LMVD=cl/λ# b+ ?- ?) K; P1 E% s/ I
式中L为供试品的细菌内毒素限值；c为供试品溶液的浓度，当L以EU/ml表示时，则c等于1.0ml/ml，当L以EU/mg或EU/U表示时，c的单位需为mg/ml或U/ml；λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml）。. f1 b1 v+ B7 I1 b7 x
如，细胞悬液其内毒素限值为2.0EU/ml，设所用鲎试剂的灵敏度为0.125EU/ml。$ J) s6 X( ?! \5 P* V* I
MVD=cL/λ=1×2.0/0.125=16（倍）# u% n  T8 R: o% L: O5 s8 {
取供试品0.125ml加检查用水1.875ml，混合均匀做内毒素检查用。) u+ C/ f) y$ _  p
2.3 供试品阳性对照液的制备$ a+ q2 P, r, p$ u/ j4 E' c
分别取供试品的8倍稀释液0.5ml和0.50EU/ml的内毒素溶液0.5ml，混合均匀供检查用。
, e- w4 P$ e' J4 ]2.4 鲎试剂的准备/ q, q3 X/ M% N1 u2 Z4 _, R% ]8 U
根据供试品的数量，取鲎试剂0.1ml/支若干，按标示量加入检查用水复溶备用。
6 e8 x* d3 `3 e8 V8 Q3 ?7 e% x- z试验加样见下表1。& E3 v3 ^4 N; F" J
表1供试品内毒素检查加样方法( S. M3 S* F0 f, ^3 C1 |0 y; f

. a3 g. {- ~; s$ [: O% K9 ], h6 _. I  ?% x' T/ w) t
测试组（A）        阴性对照        供阳组（B）        阳性对照5 J9 G9 {! B& j. j% s
        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号，2号，3号…n        1号,2号9 h/ B, L. j$ Q* K
鲎试剂溶液        0.1        0.1        0.1        0.1
; v* H+ b  F( A/ b2 h$ g- {标本液        0.1                       
, y6 C% |! G* V+ @检查用水                0.1               
' K; O: e& z) l2 c2 P( V供阳性液                        0.1        : o# c3 H) s" g7 B
阳性对照液                                0.1- @, ~# W7 m  N  A) v
2.5 检测( V% D9 g6 h/ X5 o3 u! R3 a; ?) T, ^
加样完毕，将试管中溶液轻轻混匀后，转移至试管内，用封口膜密封管口，垂直放入37℃恒温水浴锅中，保温（60±2）min观察结果。$ n5 J/ U$ A( L4 ^/ d# N
判读，时间截止将试管从恒温箱中轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且凝胶不变形，不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成的凝胶不坚实，变形并从管壁滑脱者为阴性（结果判读，当阳性对照都为阳性、供试品阳性对照都为阳性，且阴性对照都为阴性时，实验方有效）。
$ {3 K# b6 f+ ~% P' ~

fsj1987

今天做的内毒素阳性滑落，然后第二次做就没事，不知什么原因？你们都遇到过吗？

teahouse0802

我们在实际的细胞培养过程中也会出现假阳性的情况，一般出现假阳性之后都会做平行复检。我们的内毒素检测鲎试剂是不加检测用水的，直接向鲎试剂管中加入200微升待检样品，这可能和选用的鲎试剂品牌不同有关系。: |- U' k5 i+ N, }# Z. x5 ]
4根管两根原来浓度，两根稀释8倍的，如果复检结果为4根管都为阴性，则判定之前的结果是假阳性。% z1 w$ W) U) O6 b2 U$ c
如果复检结果未稀释的出现阳性，稀释8倍的表现阴性，而我们的内毒素限值是1.0，而鲎试剂的灵敏度为0.125，所以也判定为阴性。* X$ x# O& s  G1 k, i
如果4根复检管都是阳性则，则表示这份细胞不合格。

teahouse0802

回复 teahouse0802 的帖子' g8 l; R7 @; f! Q

: M* T0 C/ t( o. l! `  Y+ i8 k$ E. P补充一下，同种浓度出现相同的检测结果才算做有效。

colins

回复 fsj1987 的帖子# `' y. w( ~& h* u. I# n

0 v$ A/ ~/ a; L9 z& H1 _如果只是阳性管滑落的话，应该是你操作的时候动作幅度太大了，如果是干扰组滑落的话就应该检查你的干扰试验是不是做的合格。我偶尔碰到一些该凝胶的未凝的情况，结果复检都没事了，如果经常碰到的话就应该加强一下操作了。
2 s4 U$ c5 _* G# s- \8 V7 n" Z我觉得细胞类产品很难出现内毒素不合格，所以应该加强操作的熟练程度，我们把内毒素限值定在了0.5，很久都没见到阳性了

yingfeixiang

回复 fsj1987 的帖子5 c0 _1 c# r/ @+ c7 D  B

( i. _6 Z7 A3 x$ U* t是凝固状态后滑落的话，就是拿起看的时候剧烈碰撞了，我就又一次

baby00000003

有些个可以不通过凝胶滑落测量内毒素限度的机器. t% r" o+ R, M- j2 v" Z
通过凝胶吸光度绘制标准曲线的方法定量测量

免疫与细胞

我们说待检样品，这个是不是太过宽泛了。对细胞培养来说，何时取样、取样样本类型、处理办法（比如需不需要离心）、内毒素检测阳性指标（100ml产品来说，其内毒素含量是低于1EU还是有其他标准），不知大家有什么看法。

细胞海洋

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