慢病毒转导mES之promoter选择

christophe

最近用慢病毒向mES中转一个基因，病毒是经过50000g离心浓缩，TU值足够高，感染293T和MEF是没问题的，但表达GFP的mES克隆基本上没有。请高人给分析一下原因！另外，GFP的promoter是CMV, 这个是不是在mES当中表达很低啊，CMV \EF1-a\PGK\CAG\MSCV这些启动子在mES中哪个是最适合用的啊？

夏过秋桐

回复 深海寂寞鱼 的帖子* o0 h2 Y. @- {7 z6 `

8 Q8 Q6 u* ^8 N1 ?' |4 O, J感谢感谢，我正在做hESC也有这样的问题，能麻烦你把那篇文献分享给我吗？

feynmanzzx

精华帖，不错

salomemao

受益匪浅，谢谢大家。我最近也感染了好一阵子了，用的是MSCV启动子，说明书说是这个启动子在干细胞中表达量高，不知道各位有没有用过，效果怎么样？" u5 z( ?- ]1 O( ~

yangpan521

我用的是 IRES启动子的载体 去感染mES 细胞效率很低的 ，现在快急死了 ，老板说是mES本来就很难感染 ，说下我用的mES 为R1品系，有谁可以指点一下

christophe

回复 Elaine韩 的帖子
1 C+ j) @" D; H0 Y' s+ M( k: r. P( {  n4 Z; x+ u: K
诱导ips是SKOM基因先在MEF中表达的，CMV的promoter是没问题的。如果你用retroviral的话，诱导成ips之后会有转录沉默的现象，外源表达的SKOM都会沉默掉，也就是说真正的ips这些基因都内源表达了，不需要外源表达了，而且如果外源的一直表达的话会干扰ips的正常细胞表型。你看一般发表的ips文章，都有一个外源基因沉默内源基因表达的数据。

christophe

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! j2 R4 f/ ^- l1 v4 ?+ q* {
- {4 T) i& b" i- D 我们现在换了EF1a的promoter之后，发现表达确实比CMV的promoter强很多，而且表达的持久性要长一些。

username

回复 Elaine韩 的帖子8 S5 G* A7 I4 ?( x" W
. J2 O; ^- @, K2 Z6 X
iPS诱导成功后，主要是内源性SKOM在起作用，不用考虑外源性SKOM的作用。

username

回复 Elaine韩 的帖子4 W* a2 N  l  ^, M

6 H7 }/ [3 ~3 ]' o制备iPS使用的是成纤维细胞等成体细胞，因此CMV是可以的，而转染ESC等干细胞时需注意启动子的问题。

Elaine韩

实验正好遇到此问题，总算找到组织了，呵呵。
% a/ Y. \9 Q! j+ X, k/ i7 U6 N! p5 b我想了解一下，是不是说在诱导过程中所用的SKOM四因子不用CMV promoter的vector？
" x4 p# Q% E! E看了上面的文献，假如我用CMV promoter的vector转染诱导成功的iPS,目的基因也会表达不强，是这个意思吗？
# T0 O" ~0 v# Q" s7 P# r但是实验室资源有限，现在手头有的就是CMV的，那该怎么办啊？自己重新构建？