Car-T操作流程

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新版        起草人：lml        编号： SOP-001
& j% \2 ^1 b3 `9 t2016年        外周血Car-T细胞培养标准操作流程        页数：1/5; k7 G1 E! S1 w; u0 Q* x/ s1 \+ h
Car-T细胞培养标准操作流程9 c0 W' T6 C( s5 a5 R. K
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。: f9 P4 S+ G3 `4 \( Z0 D
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养
) D- B% n; m6 ~  g5 s' V1 g3责任人：实验员人、临床相关人员# E) F  K# X5 A$ O
4 内容
6 h+ a* o% {, |4 ]; @' f4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管! d. I/ v, \2 r4 I. F/ F
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。
$ i6 w0 j. n* J  |& E( B4.3环境：
% b1 h9 x$ l, c' K3 m4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在( B6 |: M* m4 |* g: O8 D1 h
百级生物安全柜内进行。
* H" |7 J0 |5 Y, }/ e8 d4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间
4 T* R0 w3 d! d0 Y, n不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。
2 q7 d" n5 W2 V, T3 G: h) c9 H# X4.4操作：0 ~- X1 \; U1 |, D# }; _5 E' L
4.4.1采集接收外周血
$ H0 S0 t9 z+ @% j9 f7 Z" T$ I 4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
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4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信
) [4 V$ A7 C0 b& a息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。9 \; N8 S$ m  q% s- t% u+ }' N
4.4.2操作前准备
) K& {1 c, T# j. s$ Q6 p4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安1 F' S( F# N5 U6 h/ f9 j, N) C4 S0 }: z
全柜运行稳定。
# U4 u: Y- L7 _9 J. f1 O4 k4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。5 k/ D3 u/ r. e* C7 D% u, s
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
" C: c$ n! P+ m5 E% y( {0 M4.4.3  分离单个核细胞（PBMC）： & }% }" e1 G# I2 ^+ U
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋5 k! ^5 ^$ x/ D; M  D8 q
内外周血转入50ml离心管中。
  T+ r0 H; r9 _# h/ m4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
' W. P3 q" j. F, l( H9 K2 h4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。- N( n& l& o0 W! y
4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min，慢升慢降。
% t+ @% k+ e* }* _0 q4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处
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) U. c. p1 J( T: f' S9 q  H/ {弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细
* p: ]9 y5 o* Y' e5 {胞悬   液体积比应大于1:3，混匀。6 P4 D4 V6 A& E9 l% k
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。: R. \$ n1 [! C0 y6 S
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。0 e% I' B0 h. X7 O% t2 n$ `* G
4.4.4细胞培养：2 i/ f" X3 O) D! {& j, F
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞
0 i' T4 Q3 x7 O培养基PH值7.2-7.4。
+ z$ B. A' h% V2 p1 ^* Q9 d4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)。混匀放入CO2培养箱培养2小时。# [# H; }/ a0 e' X
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
: }4 K9 K7 N2 n# H5 y4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
# W3 |5 o' e. j4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。6 F2 O7 b$ B% r! S
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4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。2 d7 k9 v- u$ F, x' K, T
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。7 y8 N1 P' F$ E
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。5 t1 y  K* ]& Z: \
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
* f. Q* E9 f) w  z% I4.4.5 Car-T细胞收集：( o' P4 E- Y" R0 Z
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。
$ g; o" I. t7 l1 O4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。) [1 d: h4 C( _- v
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。
" M& h  d# t) m% }4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
+ ~& l, {' R, U% J+ s4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。
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0 @) ?9 k8 @+ N( g; ^5 D1 y细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：# K, f: c0 E  c7 K( e- |
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。8 n- x- t6 i4 j( ?
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。1 r: n; ?+ v8 L) @  c3 E
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。/ d4 P' S5 |: R; k8 T% l0 ^
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。
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# ?' F  E) x" z. R% y$ s2 A8 `9 t7 x/ d8 m6 l0 V. J6 f

yooung

谢谢分享！

我的小宝贝

谢谢分享！

吕小松

这是car-T么？转染在哪儿？

biluolinyu

回复 吕小松 的帖子. r6 J3 i, P8 b8 D
: V+ d* l( o* P% ]
在   4.4.4.5 里面写的 $ t) x2 O' w1 S3 M
次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。

a276038921

感觉不像啊

苹果树

为什么没有测转染率呢？怎么知道病毒就转进去了呢

swtarron

怎么感觉不像啊

easyess89

我们医院现在做的是DC-CIK，治疗效果个体差异比较大，CAR-T貌似更高级些，它的治疗效果如何？

ET生物人

不用筛选Tcell？？病毒感染一次就可以？感染率是多少？