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制备CIK首先进行分离淋巴细胞，分离淋巴细胞是许多实验最基本的技术，也是关键的技术之一。现在大多数用的密度梯度离心法。一般我用5ml抗凝血就可以得到pbmc大约4－5x106的细胞。现在将我分离淋巴细胞的经验于大家共分享。- n' z7 i( }- v' k: G
一些经验+ d4 x) g6 k8 k% G' G
1，新鲜血（肝素抗凝20u/ml）＋1640（无血清）培养液按照1：1 稀释
! _$ e: q+ ^1 o( ?& E, T2. 在10ml玻璃试管中预先加入淋巴细胞分离液，使分离液：1640：新鲜血=1:1:1(最好用玻璃试管，分离液的量可以增加些，我的经验是1：1；1足够了！！）% m: W0 l9 ^9 S; c; p
3.小心的将稀释后的血液加到分离液的上面，开始的加入一定一定要慢，要尽量的贴近液面加。
7 N3 E4 ]5 Y; X# _; T; C* B' Y4. 离心 .转速 ：1500/分 . v$ s" U: r3 O. G6 w
温度20c －28c
* m0 z) M4 k: s9 l' d时间：20分钟1 g8 l4 M0 i# k
no break（就是不要刹车，这个很重要，不然由于急剧的减速度，会把已经分离的单个核细胞 层又弄混了，加速度也最好不要太大)
) Q( T7 y2 r1 M+ H. s; j5。取出试管，看看是不是分为好几层？？顺次为血浆---单个核细胞层－－分离液－－红细胞
/ b8 V" v/ b7 q6 ^& m2 G( e6.用毛吸管吸取上面的血浆层，注意无菌，保存好，留着有用！！！！# u+ W C0 ?/ c) U8 `( ^" }
7.用毛吸管，吸出单个核细胞层（白白的那一层），重悬于（2—5倍体积的不完全培养液中）.你会问：混在其中的淋巴细胞分离液怎么办？别着急。还有办法的。; @/ n! U) M+ R% l* P
8 离心。 转速：2000－2300/分 （转速一定要提高，不然淋巴细胞很难与分离液分开！！). P1 u3 v$ j+ I U# W9 D# ?
时间：10分钟2 a/ T# o% ~. y3 `
温度：4c1 j! u) o" [' ]6 s! }7 o
9震荡后，用培养液重悬至1ml（为什么？嘿嘿，马上告诉你）
' d9 v- g' A, r7 z: ~# w5 s( O10.细胞计数＋洗涤细胞。刚才不是重悬到1ml吗？取一些放于96孔板中留着计数用（100ul足够了），然后细胞悬液在离心机上离心，在离心的同时，计数你得到的pbmc吧。这样是不是很节省时间？？
( H4 d3 ^0 e7 O! s9 r* T6 [11.计数细胞：计数细胞用的细胞计数板的结构是四个角有4个大正方形，每个正方形有16个小正方形., e; b$ J: e# h
a. 取96板中的细胞悬液10ul，用3％冰醋酸稀释到原来的4倍（这样既能溶解红细胞，又保证细胞浓度不是很大，方便计数）$ k% M/ N9 W& `9 c/ W/ C; E
b. 从上面的稀释悬液中取9ul于细胞计数板上，开始计数细胞
3 i3 @3 j' K% K! ]3 H/ M$ cc.计数原则：对于压线的细胞，只说左边的和上边的。总共数4大正方形
) g- w+ v' _0 t z* H1 Q K. ud.计算细胞浓度：4大格细胞的平均数x 104 x 4 得到的就是细胞的浓度
! y: d) G+ `( n( z9 }, j; B0 ae 细胞总数是：细胞浓度x1ml（现在知道为什么重悬到1ml了吧？）2 Z% a5 x8 G* b' _! z, @$ {
12.培养：取出离心的细胞，震荡，按照每个孔1－2x106个/ml的浓度，将细胞用10％NCS+1640重悬后加入到24孔板中，然后拿出保存的人血浆，2滴/孔（经验得知这样，淋巴细胞生长情况会更好）。加入rIL-26 {/ o; O) I, J: ^
25－50u/孔后，放入培养箱. |
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发表于 2009-10-15 16:46
发表于 2009-10-20 17:50
