如何用PCR扩增长的片段

chenhuachen

回复 weiyepan 的帖子5 \/ ]/ ]1 L! Z& s9 y0 {+ o

0 S* A- g$ L! L$ z. R你好，想问一下第三条中“逆转录文库”指的是不是cDNA？

julia20

回复 weiyepan 的帖子
) x+ T2 Y/ p/ p3 l+ k6 B5 Q% V' C4 Z+ t4 i( o3 Y" }+ r7 S9 s
长片断是在基因组或者是逆转录文库里面是什么意思? 这些不好做, 那在其他什么情况好做呢? 谢谢!

weiyepan

回复 chenhuachen 的帖子# U6 ^5 A4 }  [
; j) E9 N5 J# ^/ y
是的

weiyepan

回复 julia20 的帖子5 Z( Z4 ], p! ]6 T* c* D
, N9 t4 P* `: V, `. J0 t
cDNA一般很少能转到5k以上的，一则反转的体系不行，二则常温合成RNA的二级结构影响很大。基因组用Taq好扩，这是公认的，而长片段Taq又容易引入突变，所以在基因组里面拿长片段不太实际，只能分段扩。

石山巨石

7KB 不是非常长 可以直接做的 不用桥接

zhucexiaji

7kb不算太长，你可以在NEB, TAKARA等公司选择他们的长片段PCR酶来扩增，引物设计按他们的推荐要求来就可以了，简单的很，不过模板质量要求要高，呵呵

yiyi8909

公司有卖专门扩长片段的酶和buffer，注意dNTP的量要相对增加

碧螺春的秋天

用KOD高保真酶，不用桥连，直接P就可以。如果条带不特异或者不亮，可以梯度PCR摸一下最适退火温度，循环数不用太多，延伸时间要足够

chenhuachen

回复 weiyepan 的帖子/ i4 b" b' y% J( J( J2 }; Q
, @- [  d! ?$ z* F, a1 V. O
你好，想请教一下：我最近在扩TP53的全长，用tiangen的hotstart taq酶扩增后条带很弱，怎么办？是taq酶的问题吗？另外最底下的引物二聚体比较亮

weiyepan

加点betaine，初始模板多加点，循环数+5