如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR) t, u. A2 |3 u* T! R- d4 A
会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈
2 l5 F* y  S" ]但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

- B$ W; s  M- B' E3 ^- T
( ]1 _  y& h) T$ I选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；
) W0 G* y' U$ c& J' j* \6 B如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；- ~7 |2 t4 e( i7 b8 w
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。5 `' K, f1 s& J1 a9 z% \
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！9 p# Q( Z) N" l& T
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger 5 X" }- X. O5 i% g$ |
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：
6 v0 T, g0 R& v0 m+ y首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；" ?" L7 F: v6 N0 W% r' b
第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；* \4 f% v) `. }; H" ]
第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。6 D( Z& A; Y1 U; r% ]( e4 A: S
普通 PCR反应：! ?1 G, D, u2 V( b7 |
Taq DNA Polymerase
$ V( P. F' B6 o: GrTth DNA Polymerase
: q- W% l. R2 j: e$ L+ c高效率 PCR反应：0 V4 y8 z9 |# b  r
Blend Taq
2 ]7 \, i9 P# D# E9 \" z* y  W! @Blend Taq Taq-Plus Plus-
; }( N" v9 P5 D& {% VKOD Dash (LDP LDP-101)
2 @. H1 o% x  D! xKOD KOD-Plus Plus- - K$ A6 H( @+ N! ?
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
) s$ r* z' n% E# j; KKOD FX 8 |0 u' z, Z, X+ u: K
高保真 PCR反应：
. x$ _# Q" L8 NKOD DNA Polymerase
5 p, U& f3 X1 X# CKOD KOD-Plus Plus-
& j# |7 p4 }6 r8 |KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 1 `+ w( C7 w4 n7 m8 G$ B, |
KOD FX
. Z# ]  Y+ f: M$ [3 q/ M长片段 PCR反应：
+ l. ^, R8 f+ ~6 wBlend Taq Taq
& t- N/ p0 i2 |* ~' t( iBlend Taq Taq-Plus Plus-
( ]) L' b  r# C9 {) PKOD Dash
& e3 r5 w# A# F$ s, J9 IKOD FX

exin11

学习了