如何用PCR扩增长的片段

plando

最近，需要扩增较长的片段，约为7kb，有什么简便易行的好方法？请教！多谢！

ziyunfei1982

选好的PCR用的酶，要求保真性高的，扩增效率好的。分开几段扩增，然后桥接PCR
' F8 G3 _2 s. B" X( _会很辛苦，看运气了。

hawkyiger

进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

franklinhg

用高保真的PCR聚合酶probest基本可以解决这个问题哈9 A# j  z9 c8 r' Y
但是实验的时间和工作量都比较大

shihuijunm

3 @& h9 A) O2 H$ z. q+ b1 m' f
' v; P* v, w/ Q1 {! k
选好的PCR酶，保真性高的,

shihuijunm

选好的PCR酶，保真性高的,譬如Pfu DNA Polymerase ；能满足长片段目的条带扩增的需要。

weiyepan

如果条件比较好的，强烈推荐使用NEB的Phusion酶，1分钟4kb，扩30循环可以50%以上克隆无突变，扩出来片断又浓又干净，本人亲身验证扩增13kb条带，又快又好用；; S1 U* P" \/ N
如果条件不是太好，可以用我们公司的HSHF，就是扩出来浓度比不上NEB的，速度和保真性可以保证和NEB的一样，buffer和NEB的比也有自己的优势，可以做出一些他做不出的；6 q2 y- e7 Q; _0 m7 U3 \3 R
如果是扩基因组，可以用Takara的酶，我们做很多UTR都是用takara的做出来的，NEB的不太行，具体什么原因我也不清楚。* n* h. o  T' a* m9 X9 p( S; m
最后说一句，没有最牛的酶，只有最牛的技术员，哈哈！！) o+ k+ |- s! \5 `' y) }  Q
本人PCR牛人，大家交流哈。

weiyepan

回复 3# hawkyiger ! d0 N- M3 d2 n) b! j: f3 b
另外拍一下hawkyiger的砖，PCR的引物不是看长度论退火的：. s* \  H1 ?$ _
首先，引物设计推荐使用Primer Premer 5，直接算引物温度，算出来是比较准的，实际做的时候还可以提高1~2度，有时候引物就算20多个碱基，但是Tm才不到60度，是要看GC含量的；
3 I3 g$ `' J9 I% i$ E4 K第二，并不是说TM要在60~68之间的最好，其实如果能拿到短引物，特异性比较高的，就算50多度也是很理想的。有人说长引物特异性高，在我看来这是不对的。长引物更容易引起错配，大家可以自己去想想为什么。错配是可以在Primer Premer 5里面找出来的，如果算出来的自由能>20，那么这个引物已经很难做了，如果自由能>30，我建议重新设引物算了；
1 _& _! d8 H- C, ]/ v0 ?+ G% l第三，如果你的长片断是在基因组或者是逆转录文库里面，我建议就不用做了，因为能扩出来正确的几率微乎其微，还是去找模板实际。这不是酶和引物可以解决的问题。

yueyongheng

个人认为TOYOBO公司的PCR酶系列很不错，尤其是KOD FX 。
' @# {" E5 m/ V普通 PCR反应：) v$ y3 s, q  c- G; ]3 x+ @
Taq DNA Polymerase 5 d3 z# r$ P2 P" c0 n! D
rTth DNA Polymerase
) m6 }( _8 Y0 `高效率 PCR反应：
/ e# \9 Q; p: J/ }! j& U7 R6 qBlend Taq
+ u6 x# R2 a4 H$ ~+ NBlend Taq Taq-Plus Plus- 5 g$ F% }: @, s; Q7 ^- D" c
KOD Dash (LDP LDP-101)
& V: i& a4 x$ c0 `9 t; K9 `& wKOD KOD-Plus Plus- 3 A8 r0 @3 P5 J5 B+ J
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2
8 ^8 D9 \7 R, z, \KOD FX
  {, V- F6 `0 W" A- l高保真 PCR反应：0 r* c; k# w0 _5 v" a; d- V
KOD DNA Polymerase4 V$ \# ?6 X! ?
KOD KOD-Plus Plus- # p! U8 z% j- |6 s8 l
KOD KOD-Plus Plus-Ver.2 3 u; C% s' M" r+ u* @/ X: Y4 K5 i
KOD FX / S; ]! u0 b8 s5 g5 O
长片段 PCR反应：8 t/ m$ L" m3 H5 h' A4 |
Blend Taq Taq
7 S1 c, u2 U3 ]) O2 ~6 nBlend Taq Taq-Plus Plus-
/ H' I9 G4 {$ a2 G, V/ kKOD Dash
- W+ P7 O4 \( J/ p& |  |KOD FX

exin11

学习了