关于外周血干细胞分离实验几点疑问

duoduo777001

以下是我们在做外周血干细胞分离时候步骤，但实验效果不理想，望赐教！谢谢7 ?9 d$ q7 n3 T" X; N- d
1、取兔血30ml，平均分装在三个试管里。2 z  z: E5 S( [. A
2、取3个新试管，分别加入10ml的histopaque（1007+—0.001）% l# u; Z- F: T1 O  q
3、离心，400xg 1h
. P9 [' o+ k+ o* R4 i; D: j4、离心后出现4层，提取出白色薄膜层。( i( C( N2 L- }; O, m" d1 m3 R
5、像提取的薄膜中加入5ml 1xpbs. u/ P9 N5 i  E% j: ]# J
6、250xg 10min 离心6 \  j& ^$ W) W; W9 J0 o/ C& ]
7、弃上清后加入3ml 1xpbs，离心，250xg 10min（重复2次）3 q! T) g  o) z0 d! B9 y
8、弃上清后，加入0.5ml1xpbs吹打，转移至dish中，最后再向培养皿中加入1.5ml的DMEM培养液（10%FBS 1%p/s），再于培养箱中培养。5 w" S7 d( p& d( P% T  A! K" s& t
) m+ z9 W- V" Z% Q" O# u; Y6 H
问题：1、在这个实验加入hispaque之前没有加入与血液等体积的PBS溶液，请问这个溶液加与不加都可以吗？/ Z& G, T1 j6 C7 s: H( ^1 M! H2 q
      2、取白膜是十分困难，每次离心后看到的白膜基本处于透明色，且非常薄，十分不易提取，有没有什么好的办法可以建议一下，或者说实验步骤上有哪里需要改进。9 G6 F+ ]# l" s
      3、对于第一次离心的时间上应该如何把握，与血液的量有什么样的关系，如果有，是怎么样的比例。
( p! }; n( c. ]9 b% [( B1 w谢谢赐教！

yuheng

没用过histopaque，但用ficoll分的时候必须要先用PBS稀释血液。4 \7 _- h4 G0 v5 L
白膜少极可能与离心有关，建议离心时关闭brack。ficoll方法分离时采用2300g*30min。8 f& ?3 k" {" |# p' ?
另外不要摇晃离心后的管子，防止破坏白膜