小鼠MSC冻存及复苏问题

feiyang

请教大家。冻存及复苏小鼠MSC时，如下步骤对吗?冻存：加入胰酶消化，加入培养液中止消化，离心1500rpm，5min，吸去上清，加入少量PBS重悬再离心，吸去上清，加入冻存液，按温度梯度保存。复苏：迅速溶解冻存管内的液体，移入离心管并加少量PBS离心，吸去上清，再加培养液重悬接种。

清影

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呵呵，我也是这样做的！冻存注意程序降温就好；解冻时注意37度迅速解冻就可以了

feiyang

中止消化离心后 ，要不要再用PBS洗一遍，离心多了不是会影响细胞活力吗？

清影

PBS洗后离心，影响多少是有的，只能标准操作把影响降到最低

Jocelyn

终止消化并离心后，加PBS重悬不是必须的吧，我们没做这一步，影响不大，多次离心对细胞会有一定损伤，可直接加入冻存液冻存。

nydfy

中止消化离心后 ，不用PBS再洗一遍，没什么必要，我一直没这么做！复苏时，最好将溶解后的液体移入含FBS的培养液中，可以更好的保护细胞！

why121

我是用的高浓度血清和10%的DMSO冷冻 没加培养基 复苏后状态还不错

916love

本来就是提纯的细胞，无需再离心，离心对细胞损伤

若兰汀

说一下我的方法吧：细胞铺板90%左右弃培养液，用PBS洗涤两次，就可以用胰酶消化：50m2培养瓶加1ml胰酶，消化1分钟，镜下观察有少许细胞浮起（细胞开始收缩变圆）则立即弃胰酶，然后加入DMEM培养基（含20%-30%FBS）终止消化，一般50m2培养瓶我用4-5ml培养基终止消化。用吸管将细胞轻轻从壁上吹下来，再吹打均匀，最好不要敲击瓶壁，吹匀时不要产生气泡。将灭菌的冻存管准备好，每管加入0.9ml细胞悬液，再加入0.1mlDMSO（即DMSO:细胞为1:9）此过程要轻柔快速。然后置于4度，20-30分钟，-20度2小时，-80度过夜，长久保存则置于液氮中，2-3月内使用则放在-80度即可。据说DMSO遇到细胞悬液会产热使细胞受伤，所以本人倾向先加细胞再加DMSO，此顺序尚有争议。消化的细胞膜会有受损，且有评论指出DMSO在常温下有毒性，操作时尽量轻柔快速。照此法保存的细胞冻存3个月，复苏后活力不错，24小时后细胞均贴壁。

茶水

我的经验：PBS洗涤两次，0.25%胰酶（含EDTA)消化,培养基中止，轻吹下，离心。吸去上清，加入90%FBS和10%DMSO(细胞离心过程中混匀，减少产热）1ml,轻吹，转移至冻存管中。标记好（细胞种类，代数，日期，姓名），放入棉絮中，-80%冰箱内24小时后即可转移到液氮中保存。0 B6 Z* \8 K, Q, D
复苏时，38°C水浴锅中解冻（因为现在都是塑料冻存管，传热不如以前的玻璃管，所以温度较书上37°C高点），然后吸出转移至培养皿中，再加培养基和10%FBS量。24小时后换液即可（DMSO有一定毒性）。如果偷懒，3天后换液也行。