密度梯度离心

新手

本人做外周血内皮祖细胞的分离，培养。抽取人外周血10ml，PBS等倍稀释，以1:1（或者2：1）叠加到人淋巴细胞分离液上，以2000转/分，20min离心，brake：6，温度：18度（离心机为HERMLE低温高速离心机），离心后只有3层，没有白膜层，请教各位那个地方出了差错呀？

Cherry

brake：6  是什么意思啊

Cherry

速度要快升慢降，是不是降速太快！! c" s6 m" [, C9 t- k- r* N% l, Q

deron

步骤基本正确，你仔细观察一下第一层是否浑浊，如果呈现含细胞样的浑浊的话，把离心转速调到2500r/min——另外，不排除个别的血样本身就不含白细胞的可能性。

jinyiran

brake是不是有点大了？一般做这个实验的时候要尽量将brake设置的小一些，通常就设1或者2比较好.

新手

离心机是角式离心机，离心完后，最底层的红细胞都是偏向一边，这是不是和离心机有关呢？
0 S, q# e0 [6 P5 F3 D$ l; G: Y6 E稀释的血液叠加到人淋巴细胞分离液上后，半分钟红细胞就会自动往下沉降，离心之前界面就有些浑浊了，这会不会影响到离心后的分层？
7 G' ~1 O: z2 [0 T& d离心机上的brake是实验室老师建议这样调的，具体该调为多少呢？理由是什么呀？
7 v, h% v1 h0 H0 ~多谢！！！！！！！

parcuezhang

1、外周血1：1用PBS稀释，不加淋巴细胞分离液，以2000转/分，30min离心，去除血清（大约占一半）。
  X6 x1 O1 }6 X& @& R- P2、剩下液体：以1:1叠加到人淋巴细胞分离液上，以1500转/分，加减速为0，30min离心。8 ^3 b0 H+ h/ D. [
就可以见到白膜了。

andreqin

建议将PBS换成细胞培养基原液，利于观察

meister

建议1：
3 X+ k2 E' P, f% C/ \更换Ficoll) e. n: X' L! P* g5 N1 T( F
2. 调整转速时间  F, s) d& E. R5 W
3.brake1-35 t. j1 B1 c# I! }" M" }" j" Q% \( g
4.红细胞加入后出现沉降是正常现象，不必忧虑7 e( W8 d' O' f2 O
5.PBS和血液混合均匀，利于单个核细胞释放/ j' F# M* j7 T