密度梯度离心

新手

本人做外周血内皮祖细胞的分离，培养。抽取人外周血10ml，PBS等倍稀释，以1:1（或者2：1）叠加到人淋巴细胞分离液上，以2000转/分，20min离心，brake：6，温度：18度（离心机为HERMLE低温高速离心机），离心后只有3层，没有白膜层，请教各位那个地方出了差错呀？

Cherry

brake：6  是什么意思啊

Cherry

速度要快升慢降，是不是降速太快！- m, v' G: `7 B, Y: ]7 q) ^  d

deron

步骤基本正确，你仔细观察一下第一层是否浑浊，如果呈现含细胞样的浑浊的话，把离心转速调到2500r/min——另外，不排除个别的血样本身就不含白细胞的可能性。

jinyiran

brake是不是有点大了？一般做这个实验的时候要尽量将brake设置的小一些，通常就设1或者2比较好.

新手

离心机是角式离心机，离心完后，最底层的红细胞都是偏向一边，这是不是和离心机有关呢？" a; l9 E: N* ]) y$ c& L
稀释的血液叠加到人淋巴细胞分离液上后，半分钟红细胞就会自动往下沉降，离心之前界面就有些浑浊了，这会不会影响到离心后的分层？
% G* {0 `" W% {$ [离心机上的brake是实验室老师建议这样调的，具体该调为多少呢？理由是什么呀？
2 u" W& e* \7 ^多谢！！！！！！！

parcuezhang

1、外周血1：1用PBS稀释，不加淋巴细胞分离液，以2000转/分，30min离心，去除血清（大约占一半）。
+ G3 E6 C4 w& `2 P- y+ p. z( @& o2、剩下液体：以1:1叠加到人淋巴细胞分离液上，以1500转/分，加减速为0，30min离心。8 z* c' `2 r4 r) H( m  r
就可以见到白膜了。

andreqin

建议将PBS换成细胞培养基原液，利于观察

meister

建议1：
/ }; G) [. ~6 A; p& L3 |更换Ficoll
# n1 A' G  w, a7 _0 V2. 调整转速时间2 L# n/ g) a3 B. z1 M% |! k+ R6 `
3.brake1-3
" k5 y# i: L# q& |! x$ n! j4.红细胞加入后出现沉降是正常现象，不必忧虑: ]& t, E' K1 r: @( `) _& W+ h
5.PBS和血液混合均匀，利于单个核细胞释放4 K& H2 \$ w# K% Y% \/ \  e