求教：如何提高脂质体lipofectamine TM 2000的转染效率

mckf111

各位前辈 小弟现在做B16F10鼠黑素瘤细胞转染 用的质粒是pIRES2-EGFP 脂质体是英骏的lipo 2000
8 @7 ]0 [# k$ [  R( r  a, ]先开始在六孔板接种 大概长到70%左右行转染（因为此细胞消化后极易成团 吹打N次也没啥用 所以孔内细胞克隆很不均匀 有的地方密 有的很疏 ） 过了36-40h后 发现孔内大概只有5%-10%的绿荧光细胞 而杂细胞基本铺满 接着 消化到其余两个孔 过6h加G418（900mg/L）筛选 过三天只有少许细胞死亡 于是加压到1200mg/L 又过三天死了不少 但是新长得也很多 荧光显微镜下观察 每孔大概只有1-2个阳性细胞 于是 放弃。。。# C2 a7 \4 ]! r
请问各位 我应该在哪些步骤做如何改进 能够提高转染效率 而不至于筛选的阳性细胞太少？？？

qingbao

2 c2 `  X% z5 J
) ~& e& e- M6 l! v& q6 M( k' Y
我看转染效率的问题大家已经在这个帖子里讨论了很多：http://www.stemcell8.cn/thread-35512-1-1.html。5 j2 N- i" N  x$ a
用阳性表达5-10%的细胞来作稳定压力筛选还是有些挑战的。建议还是要把转染的阳性表达率提高上去再做后续筛选比较合适。另外做稳定筛选的G418给药压力是要事先做梯度的。给你一个我自己总结的protocol，看是否对你有帮助。
! H- |& _+ o7 \' R2 d 文档 2.pdf (27.45 KB)

2011-3-8 13:43 上传

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- C. r! F) i3 F  [. B本来想粘贴word的，但是表格会乱套。所以只能用附件，没有设下载包包的，不知最后是否需要你的包包。
4 \0 C8 h% M, a+ x4 d& p7 ]又试了一下，给你贴图了，这样可以不需要下载就能看。
+ }7 L- h4 q3 H

2011-3-8 13:48 上传

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Chunjieliu

脂质体转染某些细胞的效率较低，可以试着改变一下，脂质体与质粒DNA的混合比例，有文章指出当脂质体/DNA为1.25时，转染效率最高，楼主不妨试一下。

mckf111

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非常感谢 再问下筛选前细胞融合度大概要多少合适？

qingbao

回复 mckf111 的帖子" Y3 r4 g2 r% U9 J
. c) k) q$ D4 T# X6 f
1）在根据转染试剂说明书要求的融合度时转染，一般70%左右即可。）但是因为细胞生长速度不同，所以还要确定细胞转染48小时后或是新霉素筛选前才长满。因为生长接触抑制会降低目的基因的表达。3）确定细胞在转染后48小时以及药物筛选过程中生长状态良好。如果在瞬时表达阶段细胞不健康，可能是提示有潜在的毒性。* }9 I. m) l3 ^/ K) d! c
顺便再说几点要注意的：
3 T- e+ X- T; T' @8 a1） 得到的稳定转染细胞的荧光表达量会低于瞬时转染的细胞。因为瞬时转染时，质粒进入细胞后以游离的形式存在。目的基因的表达是通过细胞的转录与翻译机制进行的。一个细胞可能‘吞入’数个质粒，因此细胞间会存在差异。总的来说，稳定转染的细胞只含有1-2个被整合的质粒。
8 V, C. ?9 L3 }8 e+ [' |+ l( Y, r2）做G418杀伤曲线。如果筛选用的药物太浓（不同批号间的药物浓度可能不同），选择压力过强。报告基因的表达水平与筛选抗性基因的不完全正相关，细胞在过高浓度的药物中生长，报告基因的表达反而降低。过高的药物浓度也可能影响了细胞的生长状态，进而影响报告基因的表达。这些副作用在长时间的筛选过程中尤其明显。筛选后的细胞培养，建议药物浓度降低为筛选时的1/2到1/5。4 t6 P0 ~& ^' ]& a' r, o# y
3）总的来说，细胞培养时间在1-2个月内表达比较稳定，因此，建议分装冻存筛选过后的细胞，然后复苏原管，以确保细胞的统一性。
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qingbao

稳定筛选的原理：
1 [9 c! x7 s1 s! s% ^% G被转染的质粒DNA带有可供筛选的标记基因，如胸苷激酶基因、二氢叶酸还原酶基因或者新霉素磷酸转移酶基因等。当携带相应抗性基因的质粒在被转染的细胞内表达后，用相应的抗性药物即可将转染细胞筛选出来。在真核细胞中以新霉素抗性基因比较常见。
+ U6 v: N9 O3 E3 ^/ L' ~新霉素抗性基因来源于转座子Tn5，其编码的细菌磷酸转移酶可使筛选药物G418失活。G418属氨基甙类抗生素，作用于80S核糖体可抑制蛋白质的合成。因此，未转染的细胞可被G418杀死，转染细胞却能够存活。真核细胞对G418的敏感性存在广泛差异。G418的使用浓度从100～1000μg/ml不等。所以，在使用G418筛选细胞之前，应将待试细胞置于含不同浓度G418的培养液中，以在3～6d杀死细胞的G418浓度为最佳。一般来说，细胞分裂越快，越容易被G418杀死。
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crystal

最近刚做了转染，有点小小的想法，不知道是否合理：! ]' f' Q  u0 `5 b: ^
种板的时候，每孔细胞的浓度不一，这样等到汇合达到分别达到70%，80%，90%的时候进行转染，然后再根据转染效果看看，你的细胞在多少密度和汇合达百分之多少的时候转染率最高！再有就是分别调整DNA/LIPO的比例，你可以1/1.25和2/2这样做几个孔试试看，这样也许也能测得你所转染的最佳比例，自己想的，不知道对不对！

mckf111

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1 \( m/ F& d: n/ L; F0 u: F/ C* R. ]1 c) a
你的转染效率如何啊？

fendou9

转染还是要看具体情况的  建议提高脂质体也质粒的比例

crystal

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$ T% C7 B# z6 j2 A8 H( x4 I2 G  A3 r: _大概80多的样子吧。