紧急求助各位大侠有关实时定量疑问 有图

scienese

模板是三个早期胚胎  跑电泳有目的条带  但是荧光强度——温度曲线不呈典型的S型而呈抛物线型! Z: K: [4 m/ r: {1 G* h
请高人指点  呵呵呵8 [! I' ^, _. v$ _/ A& w
试剂盒买的TAKARA的
4 L" u9 `& U- j

BenHantun

你这里有几个基因，是两个吗？看溶解曲线应该引物没问题，其中一个基因应该是内参基因吧，反正有一个看上去还可以，另一个基因应该是你的目的基因，它的起始模板量太少，在没有达到平台期呢，PCR就已经结束了，你加大模板量，或者增加PCR循环数试一试，另外，你的重复试验做得不是很好，看扩增曲线的起点差距很大。你们用的定量PCR仪式那个公司的，这个图示典型的曲线图吗，我这么看着有点儿扁的感觉，我猜主要问题还是你的模板量太少了。

runsong

我猜你是由于起始模板量太少，为改善扩增效果在体系里加入了DMSO。我有个师姐的结果和你的非常相近。' O0 U6 z' h  t: F
如果细胞量少的话就不要用常规的提RNA和反转录的方法了。

scienese

回复 BenHantun 的帖子: ?; c! \4 q4 l7 ?5 F7 y4 d8 a
( c# Q' e. i% _  M$ u
我这里有四个基因，其中一个是内参，模板量我也试过了25微升的体系加到4微升还是这样，而且，我的模板很珍贵的，攒了好久呢，这个CDNA是用Invitrogen 的单细胞提取试剂盒做的。PCR仪是博日的

scienese

回复 runsong 的帖子: N( Q# {3 i) l; L$ R% B
. v8 j  u( R( J# r" X/ ^4 o2 D
我这里有四个基因，其中一个是内参，模板量我也试过了25微升的体系加到4微升还是这样，而且，我的模板很珍贵的，攒了好久呢，这个CDNA是用Invitrogen 的单细胞提取试剂盒做的。PCR仪是博日的

runsong

体系里加DMSO了吗，你的非特异扩增很厉害，跑个胶看看吧。

gact

回复 runsong 的帖子. Y- @- m" i2 L6 E; N

6 f8 L$ k  d& @0 V* D( L  W非常规的方法？
* d2 Y% Q& D, U4 D- E具体怎么提取RNA 和 QPCR？

scienese

回复 runsong 的帖子& i! Q* o9 K- O, u9 V7 L
; H4 f- }3 R/ u" a. C
体系中没有家DMSO  以前加过 但效果不明显 没有加Mgcl2好
$ @, K! j: B+ O: D! m跑电泳只有目的条带

scienese

& V2 k5 ?/ U! q; P! \  u9 O( s( j( ~$ s: c
回复 gact 的帖子3 P6 p2 ~$ W" {3 u9 x  ~# a( Z

  ^0 S. \' x5 g+ W4 z0 X' y/ DRNA用invitrogen的盒子提的（货号：18080300）
) A6 y$ R6 g3 v) WQpcr用的两步法

scienese

这里有补加DMSO和补加Mgcl2的   给位大侠请指点