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楼主: mason658616
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请教脐带间充质干细胞培养方法   [复制链接]

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发表于 2011-5-12 11:31 |只看该作者
回复 tingwuyu 的帖子- W: o0 O* A; x9 D

) g% F) w: a- w- I& J; P# r. W您好,怎么能让组织块不漂呢?如果培养瓶是否需要包被呢?
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发表于 2011-5-12 15:15 |只看该作者
回复 zhangmingqi111 的帖子( T# ^# O7 ^: K4 B, e
- M% }! R6 n( _
用吸管把组织块一个一个加到培养瓶了,摆放好后可以把多余的液体吸出来,然后盖好瓶盖把贴有组织块的底面朝上,放在co2箱中待两三个小时再取出,加培养液的时候一定要小心,让液体从没有组织块的一面流下去,不要加太多,2-3ml就够了,然后慢慢放平培养瓶,让培养液接触到组织块即可,不要使劲晃。在镜下观察的时候也要动作轻,别把组织块晃下来。
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发表于 2011-5-12 16:07 |只看该作者
回复 tangyvhuang 的帖子
4 z, Z/ ]* n5 K4 v
' A# G1 {8 ?* H3 M我昨天又做了一次,用胶原酶消化过夜,然后第二天早上又用胰酶消化,消化的组织块过筛网,滤液离心,离心下的沉淀用低糖DMEM重悬后,铺到培养瓶中,在镜下可以看到细胞了,现在就看细胞能不能贴壁生长了
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发表于 2011-5-12 16:09 |只看该作者
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回复 leungyk 的帖子
. E4 |2 D: V* {+ c0 d! N2 G
  D$ f5 S# f' q7 C3 v我想请问一下,你是大概加多少培养基呢?在放置的这一周,不用补充培养基吗?组织块会不会干掉呢?

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发表于 2011-5-12 16:34 |只看该作者
回复 mason658616 的帖子
5 Q6 W* w  q% {! V4 t/ i+ w. k( p( Z' F/ V5 W; `
谢谢~我昨天做的时候就把动脉和静脉都去除掉了,我下次做打算试试匀浆,因为用剪刀剪总是剪得不是那么碎,看起来组织块已经很小了,但是铺到瓶子里的时候,还是觉得有点大了。
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发表于 2011-5-12 16:36 |只看该作者
回复 福牛 的帖子) k. e4 q1 g. w5 m2 V6 ?- d9 `8 C
5 ^; U7 N  l. [" P
你是直接把消化后的组织块用生理盐水洗涤,然后离心,离心下来的细胞和组织一起用培养基重悬,然后铺板子是吗?

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发表于 2011-5-12 16:41 |只看该作者
本帖最后由 leungyk 于 2011-5-12 16:42 编辑 $ ?5 G# h! Z& q, Y: e

* L% k) j: _& ~/ H1 \( u回复 yanmin 的帖子* k% _# X% q6 a/ p7 T6 ~7 a3 ~

* ]  q& C8 l; h' b我也是放2-3ml, 沒有換液,一個星期後並沒有乾~
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发表于 2011-5-13 00:32 |只看该作者
回复 leungyk 的帖子% }) k  j# X7 \. `- B' }. f1 w8 q& e

! x' Q/ v# L( q& R# `培养瓶或皿倒置的目的什么呢?当培养瓶倒置时,根据重力作用,组织块会落到非培养面,然后再正置时,组织又会落到培养面上,为什么不直接让其在培养面上生长呢?
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发表于 2011-5-13 05:30 |只看该作者
真高兴有这么热烈的讨论,分享一下我的经验。
* q7 H) D; h' k9 S% i) L
/ h" Y6 }1 k* L; C9 A  }首先我的经验发现用酶消化和切块消化没有明显区别-指分离出的细胞没明显区别, 我是根据FACS表面抗原检测结果和成骨,成脂肪细胞分化功能实验结果来说的。其实切块法,很大程度是取决于胶原蛋白,弹性蛋白等ECM成分蛋白自然分解儿使得细胞释放,至少我的组块漂浮也一样在10天左右发现细胞长出。 而酶消化法显而易见的提高效率。
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发表于 2011-5-13 05:36 |只看该作者
再说一下消化酶和时间的选择:
7 q! }, U7 d; q: x# a- _2 |! s8 h9 b5 ^- i* q( J. w5 X. c9 E
我是使用胶原酶I联合透明质酸酶,大约消化1-2个小时,此过成必须不停震荡!!!个体差异导致时间差异。尝试过继续胰酶消化,似乎意义不大。; s/ A; g: `7 }" m7 [0 H
+ c- c, x: t6 o) M% O
不建议过夜消化,时间太长,细胞损伤很大。如果一定要这么长的话,要用含血清的培养液配置消化酶溶液,以保护细胞。( e' A* O7 [  ?' P

( b& n1 C7 T' N0 f还有些要说,但是太累了,主要要点在这里了。找时间再给大伙补充。
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