请教脐带间充质干细胞培养方法

cactus006

回复 tingwuyu 的帖子- W: o0 O* A; x9 D

) g% F) w: a- w- I& J; P# r. W您好，怎么能让组织块不漂呢？如果培养瓶是否需要包被呢？

mason658616

回复 zhangmingqi111 的帖子( T# ^# O7 ^: K4 B, e
- M% }! R6 n( _
用吸管把组织块一个一个加到培养瓶了，摆放好后可以把多余的液体吸出来，然后盖好瓶盖把贴有组织块的底面朝上，放在co2箱中待两三个小时再取出，加培养液的时候一定要小心，让液体从没有组织块的一面流下去，不要加太多，2－3ml就够了，然后慢慢放平培养瓶，让培养液接触到组织块即可，不要使劲晃。在镜下观察的时候也要动作轻，别把组织块晃下来。

yanmin

回复 tangyvhuang 的帖子
4 z, Z/ ]* n5 K4 v
' A# G1 {8 ?* H3 M我昨天又做了一次，用胶原酶消化过夜，然后第二天早上又用胰酶消化，消化的组织块过筛网，滤液离心，离心下的沉淀用低糖DMEM重悬后，铺到培养瓶中，在镜下可以看到细胞了，现在就看细胞能不能贴壁生长了

yanmin

回复 leungyk 的帖子
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  D$ f5 S# f' q7 C3 v我想请问一下，你是大概加多少培养基呢？在放置的这一周，不用补充培养基吗？组织块会不会干掉呢？

yanmin

回复 mason658616 的帖子
5 Q6 W* w  q% {! V4 t/ i+ w. k( p( Z' F/ V5 W; `
谢谢~我昨天做的时候就把动脉和静脉都去除掉了，我下次做打算试试匀浆，因为用剪刀剪总是剪得不是那么碎，看起来组织块已经很小了，但是铺到瓶子里的时候，还是觉得有点大了。

yanmin

回复 福牛 的帖子) k. e4 q1 g. w5 m2 V6 ?- d9 `8 C
5 ^; U7 N  l. [" P
你是直接把消化后的组织块用生理盐水洗涤，然后离心，离心下来的细胞和组织一起用培养基重悬，然后铺板子是吗？

leungyk

$ ?5 G# h! Z& q, Y: e

* L% k) j: _& ~/ H1 \( u回复 yanmin 的帖子* k% _# X% q6 a/ p7 T6 ~7 a3 ~

* ]  q& C8 l; h' b我也是放2-3ml， 沒有換液，一個星期後並沒有乾~

zhangmingqi111

回复 leungyk 的帖子% }) k  j# X7 \. `- B' }. f1 w8 q& e

! x' Q/ v# L( q& R# `培养瓶或皿倒置的目的什么呢？当培养瓶倒置时，根据重力作用，组织块会落到非培养面，然后再正置时，组织又会落到培养面上，为什么不直接让其在培养面上生长呢？

henryjia

真高兴有这么热烈的讨论，分享一下我的经验。
* q7 H) D; h' k9 S% i) L
/ h" Y6 }1 k* L; C9 A  }首先我的经验发现用酶消化和切块消化没有明显区别-指分离出的细胞没明显区别， 我是根据FACS表面抗原检测结果和成骨，成脂肪细胞分化功能实验结果来说的。其实切块法，很大程度是取决于胶原蛋白，弹性蛋白等ECM成分蛋白自然分解儿使得细胞释放，至少我的组块漂浮也一样在10天左右发现细胞长出。 而酶消化法显而易见的提高效率。

henryjia

再说一下消化酶和时间的选择：
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我是使用胶原酶I联合透明质酸酶，大约消化1-2个小时，此过成必须不停震荡！！！个体差异导致时间差异。尝试过继续胰酶消化，似乎意义不大。; s/ A; g: `7 }" m7 [0 H
+ c- c, x: t6 o) M% O
不建议过夜消化，时间太长，细胞损伤很大。如果一定要这么长的话，要用含血清的培养液配置消化酶溶液，以保护细胞。( e' A* O7 [  ?' P

( b& n1 C7 T' N0 f还有些要说，但是太累了，主要要点在这里了。找时间再给大伙补充。