请教一下，大家做转基因的怎么来挑取克隆细胞？

绿雪

个人建议用96孔板，虽然看细胞、给细胞换液什么的非常麻烦，但是对于筛克隆还是比用大皿容易些，细胞没那么容易老化死掉，特别是对于转染效率低的实验相对有效些。用枪头自作克隆环我也尝试过，但是环固定不了，加液的时候容易移动。另外一个问题是加的胰酶基本都集中在环和皿底接触的位置，中间的细胞消化不到，如果要使中间的细胞消化下来，胰酶用量就必须比较大。5 E/ o* l, r0 Z( T+ R, \
个人实验过程中的一些心得体会，体细胞转基因的稳定筛选确实是很头疼的问题，不知大家有什么更好的方法没有？

生物化学zy

回复 xiangchou812 的帖子+ _! X2 k8 m" e0 M" N4 F

% J7 F4 ], i' G. ~( w* y* j' S就是像葡萄糖口服液那么大的瓶,医院应该有很多,那瓶不是圆柱型嘛.到脖颈那个地方就细一点,这样说吧,瓶口为a,瓶颈为b,瓶身为c,去掉c,保留a与b,就是尽量保留b,因为到时候那个留下的瓶颈的高度会影响你加胰酶的体积,
  j8 m6 p6 E$ u! r% p, c" C具体做法:将这个瓶用纱布完全包上,左手捏住瓶口部位,用钳子在瓶颈稍微向下一点,使劲一敲.就会将瓶子的身子去掉.注意小心玻璃渣.完事后可以把不平的地方用砂轮磨一下就行.

生物化学zy

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9 i& }: P* L; Z% T( K/ x2 R8 Z* _  e* t* o0 d8 Q  ~
就是像葡萄糖口服液那么大的瓶,医院应该有很多,那瓶不是圆柱型嘛.到脖颈那个地方就细一点,这样说吧,瓶口为a,瓶颈为b,瓶身为c,去掉c,保留a与b,就是尽量保留b,因为到时候那个留下的瓶颈的高度会影响你加胰酶的体积,2 m* U, K* J3 n5 n( z0 F: l' p
具体做法:将这个瓶用纱布完全包上,左手捏住瓶口部位,用钳子在瓶颈稍微向下一点,使劲一敲.就会将瓶子的身子去掉.注意小心玻璃渣.完事后可以把不平的地方用砂轮磨一下就行.

wnavy200299

深海寂寞鱼 发表于 2011-5-17 09:40
# O% z+ d* x, h4 @! `9 _回复 生物化学zy 的帖子
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6 O9 I6 E$ Y8 C* E  to 生物化学zy：

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关于克隆环，说了半天，还是整张图片看看，比较直观。
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) T' ^0 ~- b" U+ H- d! s0 P" D" r* F( W! p0 k6 L- M
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至于挑克隆的方法，生物化学zy 已经说过了，
2 W# j3 W! L, Q+ K在此就不诉说了。但要注意消化时间，长了克隆就有可能养不起来。
+ Y7 c1 G: I! e前两天刚挑了几个克隆细胞，感觉有几个不太好。
6 A3 Y" ?% G9 B* ^( U再就是老生常谈的问题：注意污染！！！！* c5 u- W9 C+ D0 @. v
0 M5 v' z! i6 c2 t, \/ {
ok！
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wnavy200299

更正“长了克隆就有可能养不起来。”, D: c) t0 i: }
挑了的克隆就有可能养不起来。”
2 W( b1 v* q" [0 L! H1 ]' G' k$ J5 o8 S' q4 l7 w

xiangchou812

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; ^1 l8 I, v+ S# K
! f0 q& n! H6 V1 h非常感谢。这下一目了然。图片还是比文字明了啊。
8 X$ X5 R# s5 D4 S1 b% }不过这种方法好像只有在克隆少的时候管用吧？不过确实是个非常好的方法。) a9 l5 j' X# |, C$ P
学习了。

xiangchou812

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2 n! s* L# k' q% M! x8 E+ e
) O9 R% H8 m' ]6 J准确点说应该是打靶的难筛，随机整合的细胞还是相对容易很多的。" u+ F. j# m$ D$ P* S0 y- C
就用96孔板，一次转上两三皿细胞，做上两次应该就能筛得到的。

sheepthief

回复 生物化学zy 的帖子2 ~$ o4 Z  ~+ b3 o
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高明

yiyeqiu

我们实验室的做法是用6孔板加药物筛选，当形成稳定的克隆后，用1ml的移液枪头比较大的那一段做成环，加胰酶消化，操作和楼上的差不多了。

wnavy200299

不管用什么克隆环（玻璃瓶口环、大枪头粗短截断部分等），基本意思和思想是一致的。
* ?# B4 J$ I; R6 A& T  T- n转染一般用6cm板，转然后（12h后）分板，一般分板比例为1:10~12（1个6cm板分到10~12个6孔板），分板时不加药，次日换液开始加筛选培养液。一般10天左右出现克隆。挑克隆至24孔板培养。ok~