又翻了一篇Nature Protocol （关于ips诱导的整个过程）

huangcong1988

; `& }# v# G8 ?$ h
6 e& \7 z  e7 g0 ~7 ^在此省略实验试剂和仪器设备步骤
9 J* H) b" _8 A+ n; y5 i成纤维细胞的制备' n$ F7 C! S& U& R: b4 |
1.        从鼠胚胎（A，MEF）或者鼠尾尖(B,TTF)获得成纤维细胞。一般情况下，胚胎成纤维细胞能得到更多ips colonies/ s/ Z6 T7 E& ~( s4 _7 P
A 时间：15d& ^7 ?3 M5 c. R6 |% A
（1）        通过断颈杀死怀孕13.5d的雌鼠，分离子宫并用PBS作简单清洗。( F# y4 y; O- O+ r# O5 [
（2）        用镊子将胚胎从胎盘和周围被膜组织中分离开来，将胚胎的头部，内脏组织和生殖腺去除# t) M. P+ n  e/ n
（3）        将胚胎移至装有fresh PBS的100-mm dish中清洗，用剪刀将剩余体躯剪碎，移至装有0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)的50-ml conical tube，37°孵育20min
) d% W9 c/ B+ \5 f; D（4）        另加0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)，37°孵育20min
% C& m! a2 Y$ [& _1 a（5）        加等量的FP medium (6 ml per embryo)，反复吹打使组织充分分开8 w: T8 x2 d( c5 K
（6）        Keep the tissue/medium mixture still for 5 min at room temperature (20–25 °) 以去除杂质，将上清移至另一新的50-ml conical tube。200g离心5min，弃上清，使沉淀重新悬浮于新的介质中。
$ N* f$ H8 _; `- j1 g: l（7）        细胞计数，在FP medium中调整为1 ×106 cells per ml。通常，一个胚胎能获得约1×107个细胞。将细胞悬浮液移至 100-mm 组织培养皿 (1 ×107 cells per dish)， 37 °5% CO2 下孵育 24 h (passage 1)
' k, \% c5 e' h( s9 J（8）        第二天，用PBS清洗以移除漂浮的细胞。6 h3 S: o. W/ ]1 i0 k/ o
（9）        当细胞充分汇合时，去掉FP培养基，用PBS清洗一次，用1 ml of 0.05% trypsin and
; |* O/ E+ G( X, R  P9 p0.53 mM EDTA 消化 5 min。脱落之后，加9 ml of FP medium并吹打使之悬浮。移至新的100-ml皿并作1:4的稀释(passage 2)。三代以内的MEFs作为ips的细胞来源，避免衰老。
. S3 z8 |* M1 [* R. f! I: k, w* N( j& p# K' q$ c
尾尖（B）时间：10d
& o  o* m/ ^) Q5 f' Z( Q: t& @. X在此略
5 ^% d% ?3 p6 T& Y- Y解冻 SNL cells  TIMING  0.5 h/ {! C  P7 k6 d& R0 U6 o3 v( t( N
（1）        准备9ml的SNL medium于15ml的tube中, Z% E' ^2 H0 K- \7 f
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻SNL cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）! w0 l# ]% L: g( W! v" `
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）
5 r3 l) P! M0 `（4）        160g 离心5 min，弃上清. f4 w3 o3 ?. M$ i2 B- j# `1 t# W
（5）        用10 ml of SNL medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm皿。37°，5% CO2. Z" o& ~; M& \' P: ~# G
孵育，直到达到80–90%汇合5 T0 I& G' x' [: Y4 x% b

0 g4 R" L5 o9 d1 Z2 LCRITICAL STEP  不要让细胞过度汇合，否则会影响它们作为feeder的效果。
4 g5 M, d; p/ g; g, e0 P- E6 S; e  s' l- p& f
SNL cells的传代 time：0.5h) z& }8 @( c& d) }6 Y
（1）        弃培养液，用PBS清洗细胞一次9 V( z- J3 Z" N. B. g" {0 G  h; N, l
（2）        吸出PBS，加入0.5 ml per dish of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，室温下孵育1min
% u: J/ U2 A7 n  m8 x（3）        加4.5 ml 的 SNL medium，吹打数次使细胞成为单层细胞$ {: z2 k! s, d
（4）        通过加入SNL medium调整细胞悬浮液为160ml，移至gelatin-coated dishes (10 ml per 10-cm dish)。This splits the cells 1:16。37 °, 5% CO2孵育直至细胞80–90%汇合。This should happen 3–4 d after passage
/ H; V. P! E5 e' q& W
0 f* T0 n  N: i# A% s4 AMitomycin C-inactivation of SNL cells  TIMING  3 h
; d7 A9 ~; o, R( z（1）        直接加0.3ml  0.4 mg ml–1 mitomycin C solution 到the culture medium of SNL dish，swirl it briefly（短暂地），37 °, 5% CO2孵育2.25 h。The final concentration of mitomycin C will be 12 微g ml–1
" P$ q' Y% A/ H3 ]  f0 h（2）        孵育后，吸出所有的mitomycin C-containing medium，用10ml的PBS清洗细胞两次。
  m' i/ J  |. F0 L3 x/ @* V2 {% r( J（3）        吸出PBS，加0.5 ml of 0.25% trypsin/1 mM EDTA，摇晃使cover the entire surface，然后室温下静置1min
2 Y% S3 e6 J1 m- ~（4）        加5ml SNL medium中和trypsin，反复吹打使细胞成为单层。Pool the cell suspension into a 50-ml tube ，细胞计数。Seed the cells on gelatin-coated dishes (1 × 106 cells per 100-mm tissue culture dish, or 1.5 ×105 cells per well of 6-well plate)- j# K+ _. Z7 D% J- |, B: M
（5）        细胞之间不应该有太大间隙。They should become ready for usage by the next day.
! U6 Q' i3 v: F2 J( TPAUSE POINT
/ q. n' F$ `; L5 {3 y) }The mitomycin C-treated SNL dishes 在用之前 can be left for 最多一周
* F; Q2 p8 u5 ?( }8 N1 e; S4 |* m9 X: A3 g
解冻 Plat-E cells  TIMING 0.5 h（与解冻 SNL cells操作基本一样）
3 H7 \$ x4 e/ g- {（1）        准备9ml的FP medium于15ml的tube中5 c0 M/ ~6 k% j7 S: s* }  t2 {
（2）        从液氮罐中取一小瓶冻Plat-E cells，放入37°水浴直至大部分细胞解冻（不是所有细胞）8 _- L+ I  W, s8 w% k
（3）        用酒精擦拭小瓶，打开瓶盖，将细胞悬浮液移至the tube prepared in Step（1）5 J0 `' D- W: [% a
（4）        160g 离心5 min，弃上清3 D% j& q6 _$ b- ^" m& h1 y7 M4 x. Q
（5）        用10 ml of FP medium重新悬浮细胞，移至gelatin-coated 100-mm 皿。37°5% CO2孵育
& t0 k/ E1 z/ h9 o, c# U% x1 d（6）        第二天，用新的培养基（添加了1 微g ml–1的puromycin和10 微g ml–1 的blastcidin S）替换原来的培养基。继续37 °, 5% CO2 孵育直至它们 80–90% 汇合
  e9 o) Z+ d, N- P2 V) o- l5 m* t' O
Plat-E cells传代  TIMING  0.5h4 r) _" b, Y+ [+ G- D: J
（1）        吸出PBS，加入4 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min。轻拍，使细胞从培养皿上分离下来，用10 ml FP medium使细胞重新悬浮，转移至15ml tube中。180g离心5min，吸出上清
$ x2 H3 O0 E* l( U7 W3 V5 Y# ~8 \（2）        加入适当体积的FP medium，反复吹打，使细胞成为单层，Seed them to new 100-ml dishes at 1:4–1:6 dilution。细胞应该在2-3天内汇合! c) f0 T9 b: Q
Day 1: retrovirus production; Plat-E preparation   TIMING 1 h
' B$ L2 G3 Q0 }' h" y+ _（1）        用PBS清洗细胞，加入4 ml 的0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，室温下孵育1min* W& c1 t: i, y: t: @4 d
（2）        之后，加 10 ml FP medium 到 the Plat-E dish，轻轻吹打使细胞悬浮，将细胞悬浮液移至50ml tube。FP culture medium used in this period contains neither puromycin nor blasticidin S' X# F3 f& ^9 @# o9 P* ^! d
（3）        180g离心5min
" {- V/ K7 A3 P/ X3 U" u（4）        弃上清，用手指轻拍以打散沉淀细胞，用适量的FP medium 使细胞重新悬浮
# }4 R  U# J1 R. O（5）        细胞计数，用FP medium将细胞浓度调整为8 ×105 cells per ml, s- }7 g* ^9 t3 B' C
（6）        Seed cells at 8 ×106 cells (10 ml) per 100-mm culture dish, and 孵育过夜at 37 °, 5% CO2
$ [  M+ D0 J4 ?6 w8 k( w) pDay 2: retrovirus production; transfection into Plat-E cells   TIMING 1 h
7 J1 J7 Y. m9 F4 t（1）        移 0.3 ml DMEM into a 1.5-ml tube
+ W# V% [# v. A- w3 q/ u（2）        在（1）中的tube 中加入27微升的Fugene 6 transfection reagent，用手指轻拍混匀，室温下孵育5min
& m. l+ J& {1 ]（3）        加入9 微克 of pMXs plasmid DNA (encoding Oct3/4, Sox2, Klf4 and c-Myc)到Fugene 6/DMEM-containing tube（drop-by-drop），用手指轻拍混匀，孵育15min
" N9 Z% }' i5 W; T4 F, x（4）        逐滴将DNA/Fugene 6 complex 加到 Plat-E dish中，37 °, 5% CO2孵育过夜
8 E! E- ^5 _3 S( V
) ]& h0 C" N5 x/ O关键步骤3 f$ p) [  M6 V  r, D6 D
Also transfect with a suitable control；we use pMXs retroviral vector GFP to monitor transfection efficiency。We routinely obtain efficiency ＞80%. High-efficient transfection is crucial for iPS cell induction
5 K; L, e( j1 K& {0 T- i* e5 v
9 \% H7 V8 q: T% XDay 3: retrovirus production (continued)   TIMING 0.5 h
+ Z! E& H$ V% z& _吸出transfection reagent–containing medium，加入10ml新的FP培养基，return the cells to the incubator
" v5 B6 [. g* g: n( _3 jPreparation of fibroblasts  TIMING 1 h# @5 k# U" Q/ d, \$ ?" I; i" J
（1）        培养MEF或TTF（passage＜ 3)至约90%汇合in 10-cm dishes（约2×106 cells per dish）
& J4 L9 Y5 m8 F) E  r( q5 j$ Z; z& d（2）        吸出培养基，用10ml的PBS清洗1 ~+ w( u2 Z8 Z" s( F% V/ f
（3）        弃PBS，加1 ml per dish of 0.05% trypsin/0.53 mM EDTA，37°孵育10min
( U! @* z% ^# n2 F0 H4 r（4）        加9ml培养基，使细胞悬浮且为单层，移至50ml tube中
1 ^  k. X, a" Y+ `, ^0 C: \（5）        细胞计数，调整细胞浓度为8×104 cells per ml。移10ml细胞悬浮液至有mitomycin C-inactivated SNL cells的100-mm dish (use puromycin-resistant feeder cells for NanogGFP-IRES-Puro)。37 °, 5% CO2孵育过夜。' D/ C7 A) B* W1 o6 L6 f
Day 4: retroviral infection   TIMING 0.5 h$ O7 D7 f# n7 ]
（1）        用灭过的10-ml一次性注射器收集 medium from the Plat-E dish，通过 0.45-mm孔径大小的醋酸纤维素过滤器过滤,后移至15ml tube 。
- T  w' L2 p. h# D) {  k（2）        加5 微升的 8 mg ml–1 polybrene solution 到 the 10-ml filtrated virus-containing medium，轻轻的反复吹打使之混匀，The final concentration of polybrene will be 4微g ml–1
6 x3 h9 A. e7 G$ v3 `（3）        Make a mixture of equal parts of the medium containing Oct-3/4-, Sox2-, Klf4- and c-Myc-retroviruses.; ?: ?) ?' Q2 D. `& L1 }
关键步骤  b- t$ E! `5 _( W
Retroviruses should be used freshly.不要冷冻，否则您将不会获得ips细胞。Retrovirus滴度对于ips细胞产生相当重要，The freeze/thaw step 降低病毒滴度
# F% ^- F; u$ {2 [
8 t3 G& p- G- S# D0 U- Q9 V! T（4）        从fibroblast dish中吸出medium，加入10 ml of the polybrene/virus-containing medium。37 °, 5% CO2孵育4h或者过夜/ F+ c2 Y/ T  p7 s, ~

" O; K. S& L: N/ x3 ZDay 5 and 6  TIMING  5 min each day
) q1 T/ P# T" b, M. p24或者48h之后，从fibroblast dish中吸出 medium，加入10ml新鲜PBS
6 Q$ p; b& d6 h7 ODay 7   TIMING  5 min* Q& N7 t# p, d$ U5 P
弃培养基，加入10 ml ES medium，For Fbx15βgeo/βgeo selection, the medium should be supplemented with 0.3 mg ml–1 of G4180 W' t% g* h6 l1 y- c' t& m
Day 8–10   TIMING 5 min each day- L2 K$ x# p8 L6 {% C6 o3 h
每天更换培养基（分别在24,48,72h后）
5 R+ N1 I; b3 Q$ aDay 11   TIMING 5 min; }) b8 o( y/ ~( ]3 U
For NanogGFP-IRES-Puro selection, add puromycin to the medium at the final concentration of 1.5 mg ml–1
  D6 r2 {! \( @0 o" ?  RDay 12   TIMING 约5 min each day3 f! u3 Y4 O- N. _" _2 {# o. ?, N
每天换液，直至colony  becomes big enough to be picked up. Colonies should first become visible approximately 病毒转染1周后. They should become large enough to be picked up around day 20（TROUBLESHOOTING 1）4 q. |( U' L# y
Counting the colonies: 结晶紫染色   TIMING 1 d0 O. N7 K! a# I/ b7 ]; |. e4 m
（1）        colonies收集后，完全吸出PBS，加入5ml甲醇固定剩余细胞，室温下孵育1min5 |- V7 V8 W5 G& \
（2）        Wash the dishes twice with water.. z5 K* v3 x. c; g
（3）        加 5 ml 0.1% 结晶紫溶液到皿中，室温下孵育5min
+ c& w4 G% ?# Y  |1 t4 N3 t（4）        Wash the dishes with water6 a7 s7 \& `0 ]/ Y0 x
（5）        Photograph the dishes and count the number of colonies.
/ J+ r, h: w& y- T, j
" [( ^% x, S; I1 rExpansion of iPS cells  TIMING 1 h
8 A7 u2 ?9 J$ l& m4 o( ~（1）        弃培养基，用1ml PBS清洗细胞
' h9 S4 s% R& k: I（2）        彻底remove PBS，加 0.1 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min2 N2 Y9 n% m  N5 K" O
（3）        加0.4 ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层
# r: X; h( `2 e7 P% I（4）        将细胞悬浮液移至 a well of 6-well plate，加1.5 ml ES medium，37 °, 5% CO2孵育直至达到80–90%汇合in 6-well plates。At this point, prepare frozen stock of the cells, as follows（TROUBLESHOOTING 2）! z) L& B  F; O( _2 ?6 E
Preparation of freeze stock   TIMING 1 h
: O+ [# `1 u; I& w（1）        弃培养基，用2ml PBS清洗* U0 V& h5 G1 F$ d/ \: e
（2）        彻底remove PBS,加入0.3 ml 0.25% trypsin/1 mM EDTA ， 37 °孵育10 min
0 X2 P1 r. f- J' M3 Q# {: o（3）        加2ml ES medium ，反复吹打细胞至成为单层6 b* V" o5 T$ F6 G
（4）        将细胞悬浮液移至15ml tube，细胞计数，160g离心5min/ o' i' P, g- ~; K. n, q
（5）        弃上清，用ES重新悬浮细胞至2×106 cells per ml$ J* L" @8 w0 b' {3 M, d
（6）        Prepare 2×freezing medium (20% DMSO in ES medium) and 小份分装（每小瓶0.5 ml）( O0 z0 z: O+ m( W+ A$ d( v4 K
（7）        加0.5ml细胞悬浮液到freeze vials（冻存小瓶）中，轻轻混匀' H+ w. p$ X# S
（8）        Put the vials in a cell-freezing container and keep it at –80 °overnight （TROUBLESHOOTING 3）% z: F8 I! ^4 v- h. J5 W
PAUSE POINT
8 W6 t/ H8 C/ T$ y3 P9 KFor long-term storage, keep frozen cells in the gas phase of a liquid nitrogen tank.
) X5 v% z: a! E( _! k

sunny2829

什么时候的呀？？
9 H# _# \( @  i4 A& `: k$ U

huangcong1988

回复 sunny2829 的帖子9 b0 y: l  J# {0 F- w. ?  u7 n
0 Z+ N: p1 q; J- I1 E) D+ B: p
这个有点老咯，07年的，不过很经典，其实现在做方法都差不多，只是在原来的基础上改进

前途似锦

0.1% trypsin/0.1 mM EDTA solution (3 ml per embryo)  太多了吧  我10来个胚胎就加1-2ml  

huangcong1988

回复 前途似锦 的帖子4 }1 j3 {- o2 t+ P" p  |

% M, C/ X  d' c4 Q2 z呵呵，这个是07年Nature Procotol上的，直接翻的，所以可能实际操作时量可以酌情调整，呵呵，而且小鼠胚胎大小也不是固定的，酶活性也不定，所以有时候可以适当增减，是吧？

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。9 Z' v2 Y/ Z* _5 S
这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
  f7 M4 m9 ^# B8 F3 Q新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

midautumn

我是新人，想要学习iPS细胞的培养。有些问题想要请教一下。
2 w1 O6 s4 \; O8 k  b这里提到了三个细胞系，MEF是用于诱导iPS的吗？那Plat-E cells 转染慢病毒又是为了什么的？另外SNL细胞作饲养层细胞，是不是也能用MEF作饲养层细胞呢？
. y: r* J  c0 z, J5 w. s新人求教，问题可能小白的点，烦请各位帮忙解答一下吧！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子3 G$ K7 w: q" R% F( O' M
, f. p( ]# p( y9 o( S1 U) Q- x
呵呵，其实刚开始都有很多疑问，我也是
1 L6 |; K- W) H* b0 X9 B& r  _首先，MEF是作为ips诱导的原材料，MEF和TTF都是" S5 S6 j2 d. u; n/ N/ ^! Z. _$ P
然后，PLaT-E cell用来收集慢病毒的，因为构建好的慢病毒载体要包装，用慢病毒感染PLaT-E以后收集上清，用来感染MEF，诱导ips产生
6 c  Q( M) l0 F9 D( C最后，SNL作为饲养层，有它的特性，你可以网上查查饲养层细胞的性质，很多的，它就是在诱导ips过程中作为一种培养基质的性质

midautumn

回复 huangcong1988 的帖子- G$ }& W0 J% r6 j. t
8 R: E0 c! O8 K/ T6 Q* P( o
太感谢啦！！

huangcong1988

回复 midautumn 的帖子
5 U' K" U0 |9 I+ P4 E0 E
) U! i& @0 M0 Y+ ~没事，相互帮助嘛