免疫荧光染色

Sophia

大家好！请教一下，关于免疫荧光染色，想要进行双标，就是在一张片子上染两个抗体，具体操作步骤怎么做呀！非常感谢！

taoqilh

在一抗的时候选取不同物种来源的单抗，过夜孵育，然后用对应一抗的不同的二抗，但颜色一定要不一样，比如一个红的，一个绿的，后续和正常的就一样了; S3 N+ p" B% n# V

taoqilh

在一抗的时候选取不同物种来源的单抗，过夜孵育，然后用对应一抗的不同的二抗，但颜色一定要不一样，比如一个红的，一个绿的，后续和正常的就一样了
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sdjjfangfang

细胞先进行固定，之后破膜。二抗种属来源的血清封闭后，添加一抗，如果要进行双标，则应该选择不同种属来源的抗体。一抗4度过夜，洗后添加相对应的二抗（带不同的荧光标记），室温孵育1小时，洗后先镜下观察是否有荧光，若有荧光则进行DAPI的染色。若无荧光则说明实验步骤有问题。) c6 j; L+ c, ^6 o* K8 |
实验时记得设阳性和阴性对照孔。

bllx58

不同物种的一抗+对应Host的不同颜色的二抗即可，其它操作流程完全同普通的免疫组化

gqs2872022

首先，抗体的选择必须是选择不同种属来源的抗体。! W: t9 J. l1 A# @& `4 X4 o  A6 H
做荧光双标有几种常规方法：一是用试剂盒的方法进行。
3 `+ n& m6 `: P$ z5 R" W二：一抗可以共孵育过夜，但是这里涉及到两种一抗结合能力的问题，! t9 T( ~, S* b5 j: m
所以需要摸索两者混合的比例，以达到最好的结合效果。
% V* I- t4 F7 ^! P3 _% N; P! W三：分别弄第一一抗、二抗，再进行第二一抗、二抗。
) S# l7 E1 [, G) j: ?4 P4 Z: y    共孵育的话就涉及浓度和竞争结合的问题。可以的话最后再显DAPI。最好有阳性对照。
2 ~# C1 Y& z! Q9 C' V5 H5 y. D8 j个人认为单显的话先做红光再显绿光会好一点。

snany

染色步骤楼上的说得很清楚了，我补充一点：楼主做双标确定了有双通道的荧光显微镜或者激光共聚焦显微镜了吗。如果是用普通的单通道的荧光显微镜是不能同时看到两种荧光颜色的（因为其激发光波长不一样）。

gqs2872022

我们都是用激光共聚焦来成像，这样效果是比较漂亮的。不要在乎成本，要的是效果。
. m3 Q) \2 S: V当然没有条件的话可以单通道分别拍照，再用Image J等软件叠加也行。

nihaohao

  严重同意，抗体的选择必须是选择不同种属来源的抗体。
( S( g* W0 ~- @. M比如一种选择小鼠来源的抗体，一种选择兔来源的抗体，6 {+ M4 t' x" N& a$ D; m/ N
选好一抗，然后再选择和一抗向对应的二抗。
! \6 ~  v  S- C可以两种抗体同时加，也可以先加入一种，然后再加入另一种。如gqs2872022  所说的。
. J8 P, o# v& I  a) w这两种方法我以前都用过，感觉差不多，两种抗体同时加可以节约点时间。! u8 N* W* |, B

深海鱼

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, Y5 E4 l* U  s+ v/ u1 C我有一问题不懂，您说一抗要不同种属，那么二抗也是相应的两个种属，那用哪个种属的二抗来源的血清封闭呢？我封闭都是用牛血清白蛋白，不解为何要用二抗来源的血清封闭