抗原亲和层析纯化血清抗体

mayansen1314

我用我融合蛋白（GST+25氨基酸）做抗原已经得到多抗兔血清，我用wb及组织染色的方法检测发现杂信号极其多，我想用抗原亲和层析的方法纯化一下我的抗体，不是单纯的纯化IGg，有谁做过请给点指导建议，谢谢诶

shuixiao

你可以化学合成目的多肽（25aa） 与sepharose4B偶联  再与你需纯化的抗体共同孵育 最终用相应的洗脱液洗脱即可。
. W" A& O- Q+ q9 I! d我找了几篇相应的中文文献 你也可以找找英文文献参考。
+ \7 w$ V( J2 u) p5 {& }

mayansen1314

回复 shuixiao 的帖子8 {# D' i  Q% L5 d( m& ?% s  D0 C

% {6 t- ^% z/ {9 p1 T好的，多谢关注

siyue13

以前天天做这个抗原亲和纯化，快呕吐了

langziforever

楼主有没有想过优化western或者免疫组化的条件，因为你的抗原肽太小了，所以才会和较大的GST融合表达，但只有25aa做抗原，那这种抗原刺激下的抗体也许效价比较低，也会有很多杂信号。所以，如果这种情况你即使纯化可能也改善效果不大，建议你还是优化下反应条件。或者，你可以不用GST融合，我们以前针对这种小肽的时候，经常会把这25aa进行串联表达，然后作为抗原制作多抗，有时候也会有很好的效果，但是由于不同蛋白的抗原性不同，所以，结果如何也看运气吧！

mayansen1314

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1 V0 j; Z0 f  H, E6 t& A
) \; R$ i0 x9 T* y3 A多谢指教，western的条件我都筛了两个月了，杂信号太多就是我得出的结论。我在公司人工合成了一个肽段，已经进行免疫了，但效果不是很理想，可能是我合成太短免疫原性太低。哎，愁啊

mayansen1314

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* D8 b, q- U6 q9 {% m) }' S. I
* P; F, O' r8 s/ j7 E9 L有个问题想请教，在做这个亲和层析的时候你抗原抗体结合之后用什么条件再把它们拆开洗脱下来呢？还有，如果你抗原抗体洗脱下来了，在你这个洗脱液的环境下，抗原还能跟我的组织目的蛋白结合吗？有难度，理论上不可行啊

langziforever

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7 J0 B2 j5 I8 j+ Z% v* O. T1 s! R- S# m3 y9 t
这是有可能的，一般免疫原性低可以换个片段来试，可你这个片段太短了，所以，比较困难，不知道你们是自己打兔子制备抗体还是交给公司？有没有尝试做鼠抗，有时候兔子不行，老鼠还有可能！但还是那句话不确定因素太多了，以前有个师弟打了6个兔子，N十只老鼠，终于拿到了效价比较高的抗体，前后用时2年！最后，文章发的非常好！希望你也有这种运气！

mayansen1314

回复 langziforever 的帖子. U, s- Z+ g0 A6 t* y" q
5 @9 G3 T8 n2 p3 |9 N) J
呵呵刚才没说清楚，我合成的肽段就是免疫的小鼠，效价有点低，不过我这次又免疫了几只，以前都是免疫四次，这次打算多免疫几次，请问它会不会产生免疫耐受呢？

langziforever

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& t7 Y% {5 L' J) f* c# o* U2 E5 C# M2 ^8 S' A" l! h6 A+ |
我们以前一般有过6次，一般来讲还好，但是如果再高就可能效价也不会提高多少了！