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fwyou

想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

linlicau

fwyou 发表于 2011-8-1 21:15
2 |5 a+ L$ C4 v想请教一个问题，为了正确评估qPCR的扩增效率，至少三个重复？您们一般做几个、四个？还是？

) N' b: m6 K; x( F# {什么叫扩增效率？
  \5 T+ s2 `" @( W+ u/ g) v% t- K' n  U" |2 t6 ^+ g5 n( a
在做qPCR是要先test你的qPCR引物，看其是否特异。也就是在对照组（加水）和实验组中（一般每组3个重复即可。）先test一下引物，看峰是否单一，C（t）值是否合适（如果此值在实验组中为35以上，要么说明引物扩增效率不好，要么说明此基因表达量很低。）。对照组水中的C（t）值应该为N/A，或者在38以上为好。

johnnymmzhrt

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3 X# }( q6 _5 f- O7 V* _( K' a  R& W2 ?& e2 |! f0 W
你是要评估引物的效率还是别的什么？如果是引物效率的话一般三到四个重复就可以了
* V* g7 o6 [" ?$ [但是貌似扩增效率这个东西很难评估的吧 不同的引物 不同的模板 不同的缓冲液配比都不一样 甚至连不同仪器之间都会有差别的吧。。。

fwyou

呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！
1 f% u2 h! u' R每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？% h: F7 Q) |9 R/ M, t* y) G
2 r' f6 N7 T4 Q
谢谢啊

fwyou

回复 linlicau 的帖子0 H3 z$ b4 a' o5 M5 }/ C8 j3 Y
8 ]/ A0 W1 k. H3 V, k0 O$ P% j
呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个重复是在96孔板一起做完还是独立分三次去做。。。。！$ x( X# `: F3 P5 V  P0 \
每次做都有对照 还是就检测好引物之后就不用对照，阳性对照你们用的是质粒？？
0 i1 l/ U9 Y9 U7 o! [. ]8 P& T  _- I: m8 ~
谢谢啊

fwyou

对了 模板还做梯度稀释吗？

linlicau

  W9 D! G9 b( p2 w# N; G

fwyou 发表于 2011-8-1 23:58 ' `( C8 Y8 q# ]: X
回复 linlicau 的帖子4 l2 ]$ n' X% @0 b

# G2 n5 s1 k+ C9 h" L; y9 k1 B8 T呵呵 受教了 我才看 ，再别的实验室做，完全不明白，特别是实验组？每个实验组做三个 ...

8 D3 }6 G8 l- e7 q9 Y9 O4 g2 W1 B) {, f) S' e. B+ h7 g
同学，可能是我没有说清楚。我再详细说一次吧。
# B4 H8 u  [2 S) G1 w% {3 I& \: _/ a+ V8 E6 y4 u6 h6 w
在真正的用qPCR做基因表达检测前，需要对用于检测该基因的引物进行测试，测试的目的主要是看此引物是否特异（特异的意思就是只能PCR出你要的基因中的片段，而不是其他基因中的片段），- M$ G1 X* ]- I+ z1 V) C5 G% s
0 N2 M4 R4 l1 c
特异的检测标准一般就是：你做两个组，一个是水空白对照组，即：其他成分加的都一样，只是template只加水，三个重复即可；另一组是实验组，也就是template加入的是应该包含你需要检测基因的cDNA, 三个重复即可。是不是特异就看：加水的组本应该没有检测到任何的表达，C(t)值应为N/A；而实验组应该有表达，并且你在看melting curve的时候应该是单峰，没有别的偏峰。且最好实验组的表达的C(t)值应该在35以下。然后，等realtime PCR做完，最好跑个gel验证一下，是否实验组只有一条带，且这条带的大小应该与你设计的大小一样，比如200bp（一般realtime PCR片段长度为100-300bp）。8 q% s/ _9 M3 T5 q% _5 k

+ Z) }) h$ Y2 V1 w/ b3 R3 }, _如果这些都ok了，那么你就可以做你自己的实验了。
$ f9 m# \+ [2 n& n: N' S" {2 w. i+ L  }, R$ }
在做你自己的实验检测某个基因表达情况时，最好每个样品做三个重复，并且同时要做ACTIN或者GAPDH作为reference，最后要对通过实验组对这些reference基因normalize之后得到你要的相对表达值。你就可以看到在不同组织或者不同时间你的基因的表达情况。

fwyou

回复 linlicau 的帖子4 H& y* ]* [3 Q3 a  Q- T4 b
' D# E. c8 p, P/ O  e8 ~
非常感谢 。。。。

echowdk

回复 fwyou 的帖子" j9 R' D- r# n$ M6 _4 M
- r, Z" C* D* n. g2 B5 i
在检测引物的扩增效率时，所用模板是需要稀释的。我们实验室一般是做四个梯度，4倍、4倍的稀释，即：1、1/4、1/16、1/64。

mansnoopy

我们一般是复孔3个，然后整个实验重复三次