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楼主: andylee824
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MSC 冻存问题   [复制链接]

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发表于 2011-11-22 16:42 |只看该作者
回复 hwlightning 的帖子2 ]. T+ r: p' l, a5 w3 T' I, D
. u5 \. I% k0 J% p. ~1 n
请教,程序降温盒的原理是什么?为什么可以直接放-80℃呢?你的复苏效率有80%以上吗?非常感谢!
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发表于 2011-11-23 15:55 |只看该作者
冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。
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发表于 2011-11-23 15:55 |只看该作者
复苏时间要少于2min。
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发表于 2011-11-24 07:13 |只看该作者
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回复 dwl1209 的帖子
4 U( d7 W; J% A  Z" S# V& S( n6 E
程序降温盒中加入异丙醇,在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果,即慢冻的效果。
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发表于 2011-12-29 10:20 |只看该作者
之前有前辈跟我说过,细胞冻存血清的浓度不能太高,会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。
1 t; h+ k2 [8 r- ^9 Q0 R6 a冻存的话还是建议用程序降温盒,效果会比较好。
" l/ L1 d0 S/ r+ K5 D& p8 o5 S复苏的话也想跟大家请教一下,我看过有人说不离心,直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好?还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点?谢谢。
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发表于 2011-12-29 10:51 |只看该作者
冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。' W3 T; r( s: `) D
娥的操作:1.冻存液,新鲜配制后0.22um过滤后4度储,不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液(4度)重悬细胞后分装到冻存管,放进冻存盒(4度),直接放进-80度冰箱,过夜,转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃,待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种,或者去除一下下DMSO(10倍体积预热培养基稀释后离心)再接种。
8 e. ~$ C" }* `注意:从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和,细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。$ f" @! ~' M, l) \' X9 M
Good luck.
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发表于 2011-12-30 11:08 |只看该作者
回复 yuwenlan 的帖子2 ~  A$ r, J, H# p/ X$ U

  E) f4 J2 F. D% f9 r我想请问一下大家在复苏的时候,如果是用离心的方法去DMSO的话,在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西,这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来,然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生,但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?
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发表于 2011-12-30 11:12 |只看该作者
回复 deshenglll 的帖子: p4 v( `; Q* ^
$ L* T$ |8 J; t0 y( V
我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。
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发表于 2012-11-5 16:17 |只看该作者
回复 hwlightning 的帖子
: ~" Q$ e$ Q6 z4 l  E/ \4 M7 k: u3 n- |7 C: w7 A# K% K
细胞复苏时,我们都是37℃水浴,42℃会不会太高了
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发表于 2012-11-5 17:23 |只看该作者
回复 湖南干细胞 的帖子
2 F  g* x1 b3 ?; Y* r- J6 b% b4 x4 l
我复苏细胞一直用的是42℃,复苏的细胞情况都非常好。* h% E8 ^3 G0 I1 k2 S8 Q
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