MSC 冻存问题

dwl1209

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6 N" V3 W" n& o! `0 s! |请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

deshenglll

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

deshenglll

复苏时间要少于2min。

飞翔的十字架

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程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

tkpss18

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。3 t/ x1 F4 x: w
冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。) ]: b! p& v" O5 f" @) K& D
复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

yuwenlan

冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。
5 Q  b- f, K& Q4 G# T% V$ g% s娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。
% _/ G& D0 A: m* v9 g* j注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。
! H9 H' s' `: {, q. ~2 ]Good luck.

tkpss18

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# m/ Z) ?' C8 ~4 H: R7 q
8 V+ R9 D9 s9 j8 G% E: ]我想请问一下大家在复苏的时候，如果是用离心的方法去DMSO的话，在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西，这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来，然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生，但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?

tkpss18

回复 deshenglll 的帖子& E% |& `& `& k. r. s% \# j

$ [, ]9 g# u0 Q- @6 ?; U我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。

湖南干细胞

回复 hwlightning 的帖子- T8 y; k/ `; j
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细胞复苏时，我们都是37℃水浴，42℃会不会太高了

hwlightning

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* C* \0 S" a6 @; V! k
我复苏细胞一直用的是42℃，复苏的细胞情况都非常好。
8 M- n/ O) \: a, A