MSC 冻存问题

dwl1209

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# F6 @; z+ ]0 z( a: U& u% R! [2 E! Y1 C' j+ r$ R$ ~
请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

deshenglll

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

deshenglll

复苏时间要少于2min。

飞翔的十字架

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! I- M3 t4 K, W. o% w  r& k
# {6 s' O$ x: E+ ~- P6 J9 D  k程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

tkpss18

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。
8 ?0 o1 ]8 R5 i/ F" `- w: w: Q2 U冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。0 |: w7 r+ O& ]2 v+ y3 C1 v- @
复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

yuwenlan

冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。! [0 T! h$ f; I* b9 \3 A9 C
娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。
1 [  X1 b3 O0 o7 C/ E# ^  K5 }& P注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。/ N! I& J, O) v7 C8 X5 H) L' I. m
Good luck.

tkpss18

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1 V/ x- f, e3 Y7 K3 c4 N* Q
* ^! `4 l8 K+ A我想请问一下大家在复苏的时候，如果是用离心的方法去DMSO的话，在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西，这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来，然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生，但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?

tkpss18

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: O  t; _9 o7 M4 [! O- B
% l: z6 w" g; A. H4 `我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。

湖南干细胞

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5 w8 ?8 p; A8 q: Q
5 g% I5 ~2 a# F+ N; ]. f4 `7 c细胞复苏时，我们都是37℃水浴，42℃会不会太高了

hwlightning

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" p4 X0 R+ d; \& Y8 U, C, L0 F) q! B! L2 _) l# c
我复苏细胞一直用的是42℃，复苏的细胞情况都非常好。
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