MSC 冻存问题

dwl1209

回复 hwlightning 的帖子+ b# f( g; I) o( F# B: m
( \: {  N1 J9 W+ o9 z) q2 n
请教，程序降温盒的原理是什么？为什么可以直接放-80℃呢？你的复苏效率有80%以上吗？非常感谢！

deshenglll

冻存液要加培养液的。还有就是你的细胞冻存密度也要注意。复苏后细胞的活率在70%比较低了。复苏培养后这70%里面估计还要损失个10%左右。

deshenglll

复苏时间要少于2min。

飞翔的十字架

回复 dwl1209 的帖子
8 }1 ?4 {! ?0 K* w# T
  e$ Z$ k: H4 w程序降温盒中加入异丙醇，在-80℃冰箱中达到-1℃/min 的降温效果，即慢冻的效果。

tkpss18

之前有前辈跟我说过，细胞冻存血清的浓度不能太高，会对细胞往后的形态有影响。他建议血清冻存的浓度为20%或以下。我们现在冻存细胞的配方是10%DMSO+15%血清+65%DMEM。/ h( z7 w2 M( C1 c7 d1 z2 J
冻存的话还是建议用程序降温盒，效果会比较好。  g3 V+ d, a# c( @
复苏的话也想跟大家请教一下，我看过有人说不离心，直接加完培进去培养。第二天半换液去掉DMSO. 复苏的时候用离心还是不离心好？还有清洗DMSO用点滴法会不会好一点？谢谢。

yuwenlan

冻存液FBSMSO=9:1完全没问题。最大可能是操作有问题。  h) W! k6 F% ]# B7 k: r
娥的操作：1.冻存液，新鲜配制后0.22um过滤后4度储，不超过1周使用。2.冻存细胞时候冻存液（4度）重悬细胞后分装到冻存管，放进冻存盒（4度），直接放进-80度冰箱，过夜，转液氮。3.复苏细胞要尽快将细胞从气态液氮或-80度环境置于37度水浴摇晃，待还仅剩一小小块冰晶时候取出。4.细胞可直接接种，或者去除一下下DMSO（10倍体积预热培养基稀释后离心）再接种。7 H9 F9 i' m9 F/ h' Y
注意：从水浴里取出的细胞用培养基稀释步骤要缓和，细胞有个适应DMSO浓度变化的过程。7 }' f. Q3 o* Z/ g0 j% M6 C( S1 T
Good luck.

tkpss18

回复 yuwenlan 的帖子  f& c- f3 A( T4 z, H8 y

+ R) N! q5 _+ h4 t5 v我想请问一下大家在复苏的时候，如果是用离心的方法去DMSO的话，在离心完后有没有出现像Jelly like substance的东西，这个有人说是因为复苏的时候DNA会从死掉的细胞释放出来，然后会把附近的细胞团在一块。其实这个情况也不是每一次也会发生，但是一旦发生了就会有很多细胞流失。是不是唯一的解决方法就是加DNAse?

tkpss18

回复 deshenglll 的帖子* T/ g* y: \, ?5 f2 {$ g( j' s- i7 I

7 `/ o, B1 E/ x. r2 X1 f我想复苏的时间主要是根据样本复苏的体积和容器来确定。最主要是不要把样本完全解冻。

湖南干细胞

回复 hwlightning 的帖子
- T7 l( o/ L1 K* t( }% d* b: I# R' {2 c/ `* W
细胞复苏时，我们都是37℃水浴，42℃会不会太高了

hwlightning

回复 湖南干细胞 的帖子2 K( S, c' h1 f1 A

8 s, V: j/ r! t  N( b- o我复苏细胞一直用的是42℃，复苏的细胞情况都非常好。7 W  a( i, j' W% t