请教如何把多个因子连到一个质粒里去：episomal的构建。

dispassion

国内有没有做的好的实验室？请大家指点下。

wangyashuai

可以用2A肽或IRES。2A肽是在两个基因中间插入一段序列，这段序列可以翻译出一段18-20个左右的氨基酸，这段氨基酸在体内可以自己被酶识别，并切开，最后就可以把一条肽链分成好几个蛋白。IRES是内部核糖体进入位点，也是一段DNA序列，他可以折叠成类似起始氨酰tRNA的结构，使核糖体结合在他的上面，开始翻译。在你的几个目的基因中间插入IRTS也就可以使一个质粒表达出好几个蛋白因子。但IRES序列较长，多因子连在一起会是构建的质粒分子量增大，不易操作。而且其前后因子表达频率也有一些差异。

shihuijunm

这是最近看到的一篇文章中的，也是Episomal构建，你看看
. D3 Y; e% q6 u6 I% K' L; W+ D文章题目是：Immunogenicity of induced pluripotent stem cells' I% j2 V8 l3 q$ Z1 s
doi:10.1038/nature10135

jieniao1

我现在就是做这个的，我就用的是AMV启动子和IRES（核糖体内部进入位点）连接的，但是我只是连接两个基因序列，两个都能顺利表达，挺好的，我下一步是分析表达效率，其实这个和正常构建质粒是一样的，酶切，连接，有很多这样的资料的，你看看addgene的网站上，就有很多这样质粒的图谱！

dispassion

回复 jieniao1 的帖子. g' F2 q8 y# v0 a) f6 |) A

( J0 n* R& U- w) Z谢谢 我有一点不懂 如果要连接四个因子 是不是理论上要设计5个不同的酶切位点 一个一个连进去？ires怎么连进去的

jieniao1

回复 dispassion 的帖子9 W) m0 v. Z# d2 D- G1 a/ A1 ^" o  @# [
) f0 r/ i, z4 Z) h6 S
不对！从理论上讲，如果你要连入4个片段，是需要8个酶切位点，每个片段是分开的，3个片段要连在IRES的后面，四个片段中间应该有三个IRES，也就是说一个“promoter ---片段1---IRES---片段2---IRES---片段3---IRES---片段4---终止子”。IRES在很多的载体中就有的，很多现成的载体上就直接什么都带了，你到NCBI上也能找到IRES的序列，大约是600KB，你也可以自己构建个载体，这样比较麻烦，没有必要，载体上还有很多其它的重要因素，你到addgene的网站上搜一搜就能找到很多类似的载体，有的是免费的，花不了多少钱！

zzp40

但是构建好的episomal质粒分子量很大，转染细胞时候很困难，请问大家是怎么转的呢》有什么好的方法或好的转染episomal 的试剂可以推荐吗？