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无图无真相，楼主最好发张图片上来
# E( L. i4 N% \0 x N1 w. F3 C细胞的细菌、真菌污染及排除
2 o) M$ H$ n, e5 VEdit By Waiting.D
" n9 v% C z6 b& Y X8 @: R真菌污染是细胞培养过程中最常见的一种，尤其在梅雨季节进行细胞培养更易污染。污染培养细胞的多为烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。霉菌污染后多数在培养液中形成白色或浅黄色漂浮物。一般肉眼可见，较易被发现，短期内培养液多不混浊，倒置显微镜下可见于细胞之间纵横交错穿行的丝状、管状、及树枝状菌丝，并悬浮飘荡在培养液中。很多菌丝在高倍镜可见到有链状排列的菌珠；念珠菌或酵母菌形态呈卵形，散在细胞周边和细胞之间生长。镜下看时，要将培养瓶用酒精棉球擦干净，以防止与瓶外尤其瓶底外面生长的菌丝相混淆。真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。, t* a H* J: x0 V5 M
& S# Q# _5 [' b真菌污染
2 C; S' V0 x( d& Q$ c- ~0 g 细菌是一种原核细胞微生物，其大小以微米（μm）计。常见的污染细菌有革兰氏阴性菌和大肠杆菌、假单胞菌等，革兰氏阴性菌中白色葡萄球菌等比较常见。一旦发生细菌污染较易发现，多数情况下培养液短期内颜色变黄，表明有大量酸性物质产生，出现明显混浊现象；有时静置的培养液液体初看不混浊，但稍加振荡，就有很多混浊物漂起。倒置显微镜下观察，可见培养液中有大量圆球状颗粒漂浮。必要时可取少量培养液涂片染色检查以证实细菌种类；有的培养液改变不明显而又疑有污染，可取出少量培养液用普通肉汤接种或用未加双抗药物的培养液接种，也可取10ml细胞悬液以100rpm离心5min，沉淀中加入无抗生素的培养液2ml，置于37℃培养，24h可得结果。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡，造成试验失败和细胞株(系)丢失。
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& y8 a U; G2 j7 Z( T5 h3 C2 T 6 N/ T. T6 A. A3 b% H- A4 h+ S
细菌污染
% s7 C/ F. c. A 细菌和真菌污染多在传代、换液、加样等开放性操作之后发生，而且由于增生迅速，多再发生污染48h以内就已明显。在实验的最初两天密切观察实验样品是否有污染发生，有利于及时采取措施予以补救或排除。
5 f4 |& o0 B A7 ^! Z2 }6 S/ z 培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之；有细胞株留存的或可购置的，可在寻找原因后彻底消毒操作室和二氧化碳培养箱(若发现真菌污染，可在污染孔内加入1mol/L氢氧化钠或硫酸铜溶液处理)（具体操作方法可参考细胞培养污染的预防），复苏或重新购置细胞，再培养。若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采用5～10倍于常用量的抗生素冲击，加入高浓度抗生素后作用24～48h，再换入常规培养液，有时可能奏效。细胞培养中常用的抗生素及用量见下表。
$ ^: N3 o+ @$ t* X6 |2 C常用抗生素用量和效应) b) t0 G, p' }9 D# X
抗生素 抗菌谱 浓度（量/mL）* x7 K4 L) e2 f7 i
细菌 真菌 支原体
6 _5 _+ p2 R3 v青霉素 G+ 100～1000u i" z0 X, f. ]) r
链霉素 G- 100～1000μg' _* n# a* w5 l; Z q3 u, G
庆大霉素 G+ /G- + 50～200μg. {: o1 w2 ^. e% p* b5 A8 p: v
四环素 G+ /G- + 10～50μg4 I5 F. p# [6 Q% q2 i0 v) y( P% ?
卡那霉素 G+ /G- + 100～1000μg
" y: @. k+ O+ E x6 v/ G两性霉素 + 常用2μg/mL, ~7 i; m! G0 }% |5 |
制霉菌素 + 常用25μg/mL
. |* \: O" C$ I+表示效应程度, q l" B A$ |" _
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高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
0 u: P: F( ^6 p1.在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
l/ @/ m6 m# A6 _& _+ A2.分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。& ]# @& U: V2 w
3.每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。0 u: D, [8 r8 _0 y( m
4.确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。& a K. {; t. g! M
5.在无抗生素的培养基中培养细胞一代。* A) a# R" v' Q4 K! X) J6 y9 l
6.重复步骤4。
+ W$ B( e) u+ n0 q- E& V* ], y7 }7.在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
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发表于 2012-5-2 18:58
发表于 2012-5-2 19:06
这个嘛，污染不要紧，重要的是那句“留得青山在不愁没柴烧”，，，你都养到第二十了，有冻存吗？？？？9 G5 i1 @; u5 c3 l! Z3 r, q
