荧光原位杂交（fish）探针设计原则和方法

l19rna

% t: v- n" d& g& e/ o) Q! }) i' e4 I$ P3 y8 f% @$ t
最近要做FISH，但是不会设计探针，打算用cRNA探针制备法，但是探针序列选择上不是很明白，比如Oct4的mRNA探针要怎么设计比较好？: M7 {# k9 F4 R0 P, f0 Z

+ f$ o) n  ?/ G$ d+ `; K, u1 F& T看了个探针设计帖子，对新手来说，理解得不是很明白。
' f, G  g( A5 l6 U; x% \不知道是否有探针数据库可以查询？! A' _5 `9 X) z% A7 B3 H
9 P: `; d9 }4 i+ f) N
自己设计的话，长度（~600bp），特异性（3‘UTR或5’UTR？）怎么把握比较好？3 G; F7 d0 H- l0 Q! n; V

% b5 s, O# x( d2 p4 s) J求高人指导~3 b. g3 q1 ~, C+ t

妖妖空

NCBI不行吗？

l19rna

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# r* g$ d; K  Z$ F
5 G! H1 d2 J% l/ r9 e& r# x" y2 y可以啊，最近脑子短路了~就用平常的引物设计软件就行

weiyepan

$ M  p& W+ M& b- n7 |8 R1 I/ s% i, B, s* G
如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相对特异性会差点。但是你做mRNA的话，看你想做RNA探针还是DNA探针，感觉RNA探针会好用很多，背景会低点。
0 ~+ A0 s9 w3 j1 y) k2 u用RNA探针的好处就是转录效率高，得率也高，掺入比例比DNA探针要高，可以用RNAse H降低背景。缺点是容易降解，如果是现做现用，应该没问题，如果要保存超过两星期，那就有点麻烦了。
+ x4 P# T3 p7 X( P$ j4 j) s上传一篇protocol，做RNA探针的，你把里面aa-UTP换成你要标的荧光UTP就行了。
0 e; i+ S) ?1 X% t0 V standard protocol of T7 aa-RNA transcription.pdf (53.03 KB)

2012-7-16 21:30 上传

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l19rna

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! u8 q7 g: ~" T! N) r
7 ]4 S- ]" P9 H+ B% v5 |果然是高手，嗯，谢谢啦。我要做cRNA探针呢，要做胚胎的Fish

kkmmkkmmkk

weiyepan 发表于 2012-7-16 21:27
) N: B' R) ?6 \0 \( o0 S  ?如果楼主只是做体外培养的细胞的话，应该探针会好做一点，一般要求进细胞的片段长度是200~500bp，长度短了相 ...

1 \2 O( ]4 P( H, p2 `: N$ A
附件下不了！包包不够啊！怎么样速度赚取包包啊？

细胞海洋

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' `- S: a9 J& y
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s1002297748

给力

huangxf1998

在INVITRIGEN购买TA克隆的plasmid,照着说明书做。
: U3 `, b: f7 ^2 H' BTA克隆的plasmid应该是最好用的，也最简单。
6 D8 ~8 f9 @/ k' P# b几点注意：
* G1 F4 n% a' C+ a. K3 y1.一次多选几个不同的片段，因为不是每个选取的片段都能成功，原因我也不知道，经验而已。; k1 K/ h, a2 b/ {3 o! v
2.注意RNA酶的污染，一定要保持无RNA酶操作。: g$ |8 y' A+ V8 m) P
3.长度有时候不是最重要的，我做过1kb的，照样成功，但是成功率比较低。但是你的600bp应该没问题。( Z& f2 y# \2 W, g. a/ J; y$ u
4.多探索，不要怕失败。第一次做就当练手，别太当回事。9 g% S1 H9 o* z8 ?

l19rna

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# u5 V  ]. \' d# G' X) V+ R2 x9 A4 f7 k# i$ o
第一次已经失败了啊，唉，呵呵