PBMC提取已经摸索好了，准备摸索CIK，麻烦懂的人进来看一下，万分感谢。。。。。.。。

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前段时间一直在摸索PBMC，基本上已经摸索好了，现在准备开始做CIK了，但仍有几个问题不明，请知道的朋友解答一下，万分感激，呵呵！3 N- ]/ t$ n. a6 c% y
1.PBMC提取完之后，我准备放到直径为100mm的细胞培养皿中培养，问题是PBMC的量是多少，我在文献中看到的是1x10 6/ml，那一开始加10ML培养基的话，那就要1x10 7的细胞，是否比较多了？？？6 p0 Q2 `' \) f# L# C
2.培养CIK一般利用什么培养工具培养？如果我一开始用直径为100mm的细胞培养皿，养到多少天后换成培养瓶（还是培养袋？），用什么规格的培养瓶或者培养袋？？？换液和传代的时候是否要离心？
" @) @6 a( s: `9 \8 q3.我采用的方法是于当天加入rh IFN-r 1000U/ml（请问是提取完PBMC立马加入，还是PBMC培养了2H吸取上清后加入），放置5%CO2、37oC孵箱中培养24h后，加入CD3 mAb 50ng/ml、及rhIL-2 1000U/ml继续培养，每3d换液并补充rh IL-2，培养至第14、15天，终细胞数为2x10 9-3x10 9。不知道这种方法是否可行，还是现在还有什么更好的方法，望赐教。; A# y' {/ X3 }2 j* W+ L' s
4.CIK培养完成后，一般是用什么方法检测，看的比较多的是流式细胞检测CD3，CD4，CD8，CD56，这种检测方法是否能够说明问题？？？1 ~- O6 c( i/ N6 h9 @( o

8 E, D3 B. `; j8 t问题比较多，问的也比较乱，望大神能针对我的问题解答一下，谢谢！我的QQ是113305060。

花饶然

1..你用的这个密度是比较普遍的，没有什么问题，只是我不大明白为何用培养皿来养，开始就可以用培养瓶，我觉得。
! K+ P" `- d5 S2.用多大的培养瓶取决于你养的体系有多大，T75和T175都可以的。培养袋也有不同规格的供应。0 j% k5 Z; g. a
3.如果你不养DC细胞，大可以在PBMC提取完就可以加IFN的，不用等待2小时。你所说的这种方法很通用的，有的人可能还会加下白介1。如果你最终得到如上的培养量是由1乘10的7次方扩增来的，我觉得量还是可以的了。- y3 `& p6 [" J! C9 \0 q+ }( \
5.关于流式鉴定，很多人把CD3CD56双阳性细胞的比例作为一个标准。但是也有人会有其他看法，认为不一定如此。/ t6 {6 g+ A7 s5 B. y4 ], h2 |
以上仅供参考

meixue1130

我的回答和楼上的差不多
( q" E: C2 \4 k& O7 z8 {1 L1.如果只做CIK培养的话，直接用培养瓶就可以了，一般有人分离PBMC后放在培养皿里，是为了分离贴壁细胞做培养DC用。如 不做DC就可约去这步。; y/ `8 a- o& D6 S) u9 P% t. v
2.如果做预实验可用小规格的培养瓶，T25、T75都行，细胞多了就可以丢弃一些。若是用于临床的话就最好用大的培养瓶或者培养袋了，这样操作起来更方便，也节约耗材成本，若用小培养瓶，需要的瓶子太多，增加工作量。1 }+ H+ \* A8 W" U
3.因子浓度可以，加入的顺序也对。如只做CIK就直接分离完PBMC就可以加IFN-r了，若是也要做DC，就需要贴壁两小时，贴壁细胞作诱导DC用，悬浮细胞作诱导CIK细胞用。2 d/ j+ M$ [7 S5 S" }0 g" A  x' |
4，流式检测主要就是你说的那几个。

113305060

回复 花饶然 的帖子- I8 H- E7 h8 p8 p  Z

6 f# x; b8 _% Y' X8 h# d非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊% b1 }$ d$ w; I, g, q! i& d6 o# N

8 H2 s3 C/ n' n还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

113305060

回复 meixue1130 的帖子1 p% p" o  S7 o: d
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非常感谢您的解答，我还有一个细节方面的问题，就是我如果放在T75（250ML)培养瓶中培养，先按照细胞浓度加培养基，比如说我先加了10ML，然后3天后，细胞浓度增加了，我是直接在里面加培养基，还是需要把细胞离心后再换培养基呢？同样如果细胞浓度增加到需要传代（需要多个瓶子养）的时候，是直接将原来培养液分为多份移到新培养瓶中，还是需要离心后，用新培养液分至培养瓶啊
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' x  x$ I9 [) L. W8 L' g1 d还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧

113305060

再追加一个问题，就是如果从第一天（提出PBMC后加RH IFN-r）开始算，大概多少天能够诱导为CIK（能够通过流式检测出CIK）？？？？？？是不是随着培养时间的深入，CIK会越来越多，CIK本身会增殖吗？还是什么情况？？？？？？一般需要多少天能将原来1*10 7细胞量的PBMC诱导为终细胞数为2x10 9-3x10 9 CIK？？？？？？谢谢！

woosheng

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! E9 A, h. c: z( R( E[ 还有一个关于试剂的问题，培养基中加的CD3单抗是不是就是用来流式检测的CD3一抗，两者是一个东西吧]
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不是。培养用的抗体和流式检测的抗体不一样。

113305060

回复 woosheng 的帖子. k" ?* S# S! s4 b  v
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我在网上查到的细胞培养用的CD3 mAb 是PROSPEC的，具体说明是http://www.prospecbio.com/CD3_Human_Antibody_12_99/4 A  C' b, Y) U/ r0 i9 ~* G
不知道能不能用？你们用的CD3 mAb是什么品牌和规格的，能告知吗？谢谢

莫邪小仙

回复 113305060 的帖子  G7 M! F2 p" U# h* g
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这个看细胞生长情况了，有的是直接加入新的培养基有的是半量换液，目的就是保证细胞的密度始终一致，我们采用的是半量换液。刚开始是离心了之后又换液的，但是后来发现离心不仅会损失细胞而且会破坏细胞，所以我们就没有离心了，直接换液。

113305060

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: w7 m+ o* a) X$ D4 ~8 }! S谢谢您的回复