求瞬时转染后 培养上清液Elisa的protocol...

willing

如果有全步骤最好（主要是如何进行细胞上清的收集）
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另有几个疑问的地方，转染后培养48小时收蛋白和上清（或者24h收上清），这个是加有血清培养基还是无血清培养基。加血清培养基会干扰Elisa结果，不加血清细胞会受得吗？. ~3 A- q9 j! W8 [8 n6 Z! }

7 Z# K4 U" v  o0 q9 L6孔板一个空加多少培养基合适（含酚红的培养基行不？），暂时还不知道我的细胞分泌目的蛋白的量，可能很少吧。如果多加了，怎么浓缩，又方便效果又好。
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谢谢各位好心人！

shy8610

回复 willing 的帖子! X; \* @; {$ m! k9 D( n
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6孔板2ml吧，你提到收蛋白和上清，我不明白你的意思，这么说吧，如果是贴壁细胞，吸掉上清即可，如果你不放心，800g离心一下，如果是悬浮细胞，你直接800g离心，取上清，然后是收细胞，你想干嘛？细胞如果要western blot，你直接裂解，如果是需要活细胞，那么用PBS洗下来，如果要求高点，用含2%血清的PBS因为楼主表述不是很清楚，所以不知道这么回答是否满意

willing

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7 O% A1 q# T5 v5 i# \使用含血清和酚红的培养基 做elisa后续没有问题吧？( T) G1 e' b4 y- f3 c& Q+ R: r1 b
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shy8610

回复 willing 的帖子2 c$ Q$ t1 I& g2 U
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没问题，elisa检测无干扰

xiongjiedeng

你这个上清是制备慢病毒吗，收集很简单呀，24h、48h、72h，按三个梯度来嘛，按照我的经验，48h是最好的，效力最高；若你要进一步做蛋白印迹鉴定，那直接收集细胞提蛋白即可，并且能测出蛋白浓度，按照WS的要求加样就可以了，就没有必要考虑细胞分泌目的蛋白的量的问题了。下面是我们实验室蛋白的处理收集方法步骤，希望对楼主有帮助1 p2 t& b5 U, t8 j+ e+ @* A
(1) 细胞的处理
! U/ T. `* g9 \! P. h+ N' u取生长状态好的细胞进行一系列细胞实验后，收取细胞.用巴氏管吸掉培养基,再洗涤.一般来说10cm的小盘用冷的PBS溶液4ml左右洗1-2次. 用巴氏管吸掉.再加入1ml左右冷的PBS,用细胞刮刀迅速把贴壁细胞刮下来收集于1.5mlEP管.短暂离心10-20S,12000rpm.去除上清溶液..保存细胞样品于-80℃冰箱. 1 Q' N; K, Q, w) {
(2)抽提蛋白
/ `2 H0 p5 j5 q% p待样品收齐后,使用IP细胞裂解液进行抽提,提取蛋白. 首先至于冰上,轻弹EP管底部使细胞松弛.加150-300UL裂解液(看细胞数目而定,.通常取250UL左右.)于冰上操作.静置30min.(可适当延长时间.)再离心12000 rpm,4℃.15 min.取上清.即为蛋白样品.(3)测定蛋白浓度(Bradford法)# S5 @' D/ g) t$ v  W
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收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
( T2 W, A" ^5 O取2ul蛋白样品于500ul.稀释的.Protein assay(1:5)溶液.混匀.取其中100ul(or150.200). 在595nm下测定的吸光度值A595记录其OD值.再换算蛋白的浓度=ODX5 (10ul样品于500ul buffer时.蛋白浓度=OD值.)
6 R2 l( d' X& p8 |$ j. Y% @. A 再计算上样体积V=上样量(50ug)/浓度. 按以上操作测定的OD理想值为0.4—0.7. 通常大于这数值的话,上样体积较小,这样就要同比例的放大上样量适当倍数(比如按上样量60,70,75ug计算)或者用IP裂解液做稀释处理.
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