关于神经干细胞的培养 请教

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  y2 T8 B  V9 z& @5 w, j5 H大家培养神经干细胞用的是商品化的完全培养基还是自己配的比较多呢，一般培养一瓶细胞需要取几只孕鼠？以下是查了一些资料后设计的实验步骤，请大家帮忙看看可行吗，有什么格外需要注意的细节吗？' X8 |: L# i% V, u# Z
(1)取孕14.5天SD 大鼠 ,引颈脱臼。在无菌状态下剪开腹部皮肤及肌肉，取出胚胎置入D-hank’s液中。8 ]% s" ?8 B0 s3 C8 M, \% D
(2)逐个仔细分离出脑组织置入D-hank’s液中漂洗，剥离脑膜及血管,分离出海马,剪碎成约0.2mm×0.2mm大小的碎片。0 n  _. b. Z. x% q' a. K" b1 j  E
(3)加无血清的神经干细胞培养基 [组分为DMEM/ F12 (1∶1) 、N2(10％) 、20 ng/ ml bFGF、20 ng/ ml EGF 、1%双抗]，以Pasteur管轻柔吹打成单细胞悬液,再加少许细胞培养基于离心管，以获取更多细胞。
: A& c# k3 U7 L8 ~(4)台盼兰染色后计数，以1 ×106/ ml 的活细胞密度接种于培养瓶中。 37 ℃、5 % CO2 孵育,倒置相差显微镜观察。- x( A( v. t6 t; Q
(5)细胞每5－7天传代一次，收集神经球，以神经干细胞培养基重新制成单细胞及小细胞团悬液，以1 ×106/ ml 的活细胞密度传代。
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PS：还有神经干细胞的培养一定要经过自新能力鉴定、nestin 表达的鉴定和多向分化能力的鉴定吗？
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谢谢啦

湖南干细胞

回复 86964109 的帖子* }9 r3 a0 S' Y0 r+ _$ b3 i3 G

9 L# \9 U) B, I  U! R" s5 a' s我们用的是出生后3天内的小鼠，（1）先浸入络合碘淹死，然后再剪开头颈部皮肤、头颅骨，最后取下海马区，第（2）步同上，（3）培养基成分：没有加双抗和细胞因子。有谷氨酰胺。第（5）步，视细胞是否形成神经球定多久首次换液。神经干细胞鉴定尚缺经验。多多交流

湖南干细胞

是大鼠，写错啦

86964109

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回复 湖南干细胞 的帖子' G* z4 Y& O, X8 F2 X+ r* K

1 j& g: F* V1 z' n+ Q谢谢分享  不加双抗，那你们的培养环境和无菌操作一定很好

湖南干细胞

回复 86964109 的帖子' d: I6 [" d$ C6 }+ P

! S  _( A$ Z' E4 E更正：我们实验室的培养基中的细胞因子还是加了，没有加N2、双抗，加2%的B27。这方面的可以参照一下http://www.dxy.cn/bbs/thread/4477690

湖南干细胞

回复 86964109 的帖子5 @- `* \- D& A

! w  q9 X6 ]) r- N培养基的成分更正：含2%B27,不含N2和双抗，含细胞因子，浓度同上。

湖南干细胞

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6 [% [4 q" v& r4 U) W- i1 R9 K$ t: Z4 h" q4 J7 b; x
我们实验室经常用β-Tublin免疫荧光检测，实际上要测定需要做包括形态学、表面标志物等很多检测。不知道怎么传图片，附下文链接。为神经干细胞鉴定要求http://www.stemcell8.cn/home-spa ... ward-1-id-1539.html

86964109

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; ^) b- J/ a) I$ C谢谢，学习了，先看看能否分出来吧 有问题再请教

小渝

自己分离培养肯定需要鉴定，当然是所有都鉴定更好了但是肯定得根据实际情况来选，我们是免疫荧光鉴定nestin，现在很多都是鉴定SOX2这样。另外我个人觉得如果没有解剖显微镜你要分离脑组织然后剥离海马是很不现实的事情。另外就是可能杂细胞会多，单纯机械吹打可能会因为力道问题损伤细胞严重。可以试着用用胰酶替代物进行消化结合轻柔的机械吹打。

86964109

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" h" t* G  G4 L3 R, g6 I0 E  m谢谢指教，那么如果从全脑组织分离培养干细胞不可以吗，传代过程中不能纯化吗？有人用注射器推打分离细胞，请问可行吗？