怎么检测是否有支原体污染

怡雯小叶叶

如题，怎么样检测支原体污染，听说用DAPI染核，请问怎么染？

jiguojie87

1 培养基0 p2 ^# X5 X6 b( x8 G1 p- G6 A! e
检验禽源细胞和由禽胚组织或其细胞制成的活疫苗，用改良Frey氏培养基。
9 {- r+ M/ T( Y8 y1 g检验其他种类细胞和病毒活疫苗，用支原体培养基
0 X3 |+ D* X6 S5 V0 Q检验血清 用无血清的培养基
, A- {+ M5 h5 W8 g2 检查法
% L: l# i" C2 s9 v9 D/ ] 样品处理 每批制品取样5瓶，液体需混合；冻干制品需添加液体培养基复原成混悬液后混合。检测血清时用血清直接接种。, d6 }& i" q8 \6 ^9 z
疫苗的检测 接种于观察 每个样品需同时用以下两种方法检测+ w8 w1 i, ~; u/ `9 z& b$ @
液体培养基培养 将疫苗混合物5.0ml接种小瓶液体培养基中，再从小瓶中去0.2ml移植接种于1小管液体培养基中，将小瓶与小管置于37℃培养，分别于接种后5日、10日、15日从培养瓶中取出0.2ml培养物移植到小管液体培养基内，每日观察培养物有无颜色变黄或变红，如果无变化，则在最后一次移植小管培养、观察后14日后停止观察。在观察期内，如果发现小瓶或任一小管内液体颜色出现明显变化，在原pH变化达0.5时，应立即移植于液体培养基和固体培养基，观察在液体培养基中是否出现恒定的pH变化，及固体上有无典型的“煎蛋”状支原体菌落。
  P# b& I1 Q3 ~琼脂固体平板培养 在每次液体培养物移植小管培养的同时，取培养物0.1-0.2ml接种于琼脂平板，置含5%-10%二氧化碳。潮湿的环境、37℃下培养。此外，在液体培养基颜色出现变化，在原pH变化达到0.5时，也同时接种琼脂平板。每5-7日，在低倍显微镜下观察各琼脂平板上有无支原体菌落出现，经14日观察，仍无菌落时，停止观察。
7 A* u8 Q: p3 |" G. M2 ?/ v+ \对照  每次检查需同时设置阳性、阴性对照，在同条件下培养观察。检测禽类疫苗时用滑液支原体作为对照，检测其他疫苗时用猪鼻支原体作为对照。% P) i8 d) M0 u) P- P8 X: y4 V
血清的检测 取本血清50ml代替培养基中的马、猪血清，按附录38页培养基配方配成大瓶培养，按2.2.1.2项稀释、移植、培养，观察小管培养基的pH变化情况和琼脂平板上有无菌落。
. K( @5 U! L7 O3 T- B; g3 结果判定
* a$ k% A1 T) K2 v 接种本物的任何一个琼脂平板上出现支原体菌落时，判定血清或者疫苗不合格。6 r0 E: \+ z3 R$ H/ W
阳性对照中至少有一个平板出现支原体菌落，而阴性对照中无支原体生长，则检验有效。
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0 x/ R3 A( T; h6 U4 S' R0 ]0 I$ k

lumenghua

现在市场上有支原体检测试剂盒，采用的是PCR原理，一天时间就可以检测出来了，比较快捷

怡雯小叶叶

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5 i; z2 a, N$ N: P! A' F6 G/ q( h
有用DAPI染的么？

452359357

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" A9 x: q+ K+ x1 B0 ]: LDAPI介绍   ' Z4 h' W' `" `( G+ |1 q
在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激发。当DAPI与双股DNA结合时，最大吸收波长为358nm，最大发射波长为461nm，其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度不及与DNA结合的结果，其发散光的波长范围约在400nm左右。    DAPI的发散光为蓝色，且DAPI和绿色荧光蛋白(Green fluorescent protein, GFP)或Texas Red染剂(红色荧光染剂)的发散波长，仅有少部分重叠，研究员可以善用这项特性在单一的样品上进行多重荧光染色。    DAPI能快速进入活细胞中与DNA结合，因此DAPI对生物体而言，也被视为一种毒性物质与致癌物。使用过程中应注意操作与抛弃的处理程序。    DAPI 分子式：C16H15N5    分子量：277.324    CAS number：28718-90-3    光谱性质：与双链DNA结合时最大吸收/最大发射为358 nm/461 nm；与RNA结合时，最大发射移动到400 nm左右。  编辑本段DAPIDAPIDAPIDAPI染色原理染色原理染色原理染色原理      
1 `# A  U8 n& b) p8 n染色原理：DAPI 为一种荧光染料，可以穿透细胞膜与细胞核中的双链DNA结合而发挥标记的作用，可以产生比DAPI自身强20多倍的荧光，和EB相比，对双链DNA的染色灵敏度要高很多倍。显微镜下可以看到显蓝色荧光的细胞，荧光显微镜观察细胞标记的效率高(几乎为100 %) ，且对活细胞无毒副作用。DAPI染色常用于细胞凋亡检测，染色后用荧光显微镜观察或流式细胞仪检测。DAPI也常用于普通的细胞核染色以及某些特定情况下的双链DNA染色。细胞经热激处理后用DAPI染色3分钟，在荧光显微镜下可以看到到细胞核的形态变化。    a、 正常的烟草细胞核：核形完整，染色质均匀。    b、 染色质固缩，向外周聚集，形成周边化。    c、 染色质进一步固缩，形成很多颗粒物质。    d、 细胞核破裂形成碎片，核解体。  " t1 M4 s9 \" o5 P
染色步骤  
  x( @3 a9 {" Q" z: O! y) p在细胞移植前，将DAPI 以一定的浓度加入培养基中，与细胞共同孵育过夜，用PBS 缓冲液漂洗至少6 次以洗掉未结合的DAPI，在用酶消化后离心收集细胞，加入DMEM 培养基制成细胞悬液以备用。    6 P& b6 Q/ y7 T$ R8 I* t+ j3 d! J! E
存储条件：-20℃避光保存    每次使用，用量较少，可反复冻融，无需分装    注意事项：    1、DAPI强烈致癌，操作时要戴上手套。    2、贮存液用70%酒精配制，浓度100 µg/ml，可用黑纸包住，长期冻存。使用液按1:1000用PBS稀释，最终浓度100 ng/ml。    3、DAPI是非常优秀的DNA染料，固定过和没有固定过的活细胞均可用DAPI染色。

怡雯小叶叶

回复 452359357 的帖子( l6 f1 u; B2 P

+ w5 p3 z& d0 L8 n亲，我想问怎么用DAPI检验支原体污染，不要用DAPI染细胞" W; p4 e# r6 u/ l" q3 _

褚cell

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# F9 _- u( U: U  i/ Y+ ~0 g) ~! g" ]9 ~/ ]$ \& x# o: j
一般说，在支原体污染严重时，不仅细胞核区有蓝色荧光，细胞质中也有模糊蓝色荧光，是支原体造成的，不过在污染早期，不大适用，具体可行否，还要做对比试验。

褚cell

回复 怡雯小叶叶 的帖子* q  R( F' E" u7 i; j

% f2 W5 L; Y  ~5 O) X0 _补充一句，蓝色荧光来自DAPI染核后观察~

怡雯小叶叶

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0 e0 E$ {5 M3 c+ o1 F* }2 T+ O; t5 Q8 P3 d" V
thank you
# q" t% B! M7 R/ x3 U, Z

184lj

染色法检测支原体污染，一般先做细胞爬片，固定后DAPI染色；荧光显微镜下观察，干净的细胞只有细胞核染色，污染支原体的细胞 会出现点状、絮状物。