干细胞之家 - 中国干细胞行业门户第一站

 

 

搜索
朗日生物

免疫细胞治疗专区

欢迎关注干细胞微信公众号

  
查看: 62098|回复: 11
go

关于EB的形成与克隆的挑取 [复制链接]

Rank: 2

积分
202 
威望
202  
包包
838  

优秀会员

楼主
发表于 2013-6-5 16:15 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
请教一下各位:
9 T+ N) h* G. b2 ^1、如果用悬滴法形成EB的话,是使用纯的ES/iPS来进行的么?细胞量大概在多少呢?那MEF是如何消除干净的呢?
' C7 Y* p; M, m, z6 ?2、如果直接用悬浮法的话,就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么?是单细胞悬液么?MEF不需要清除么?
! w+ }1 P/ _$ V5 ~3、还有在细胞克隆形成的时候,如果需要把克隆挑取出来,各位是用的什么设备呢?普通的体式显微镜能够看到么?还是需要什么特殊的配件才可以?
" z4 B. G; n9 P谢谢各位!

Rank: 1

积分
19 
威望
19  
包包
72  
沙发
发表于 2013-6-19 10:43 |只看该作者
这是小鼠的还是人的iPSCs?人iPSCs用悬滴法不太适合。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
212 
威望
212  
包包
271  

优秀会员

藤椅
发表于 2013-6-20 17:26 |只看该作者
回复 your1024 的帖子
8 ^8 @! @: C6 i* f, c2 j1 f
4 c: z* l& D3 R/ X$ U+ i4 t; [# A8 _要是人的ES或者iPS的话,消化后吹打成比传代克隆稍大的克隆,收集到离心管,静置一段时间除去上清后,加无bFGF的培养基重悬,转移到国产的细胞培养皿悬浮培养4-6天即可。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 6 + 15 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 6  包包 + 15   查看全部评分

Rank: 2

积分
58 
威望
58  
包包
285  
板凳
发表于 2013-7-12 11:01 |只看该作者
干细胞之家微信公众号
1.去除MEF细胞,你可以把消化的细胞,先置于细胞培养皿中37℃培养半个小时,残余MEF应该都贴壁了,将细胞悬液吸出,用这个悬液形成EB。
! E5 w$ H1 [& X" t4 ~2.如果是小鼠的ES/iPS,消化后是单个细胞,悬液制成(1-1.5)*10^5/ml,20μl形成一个悬滴。悬滴培养2天后,转移到petri dish中悬浮培养。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 6 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 6  包包 + 20   查看全部评分

Rank: 2

积分
58 
威望
58  
包包
285  
报纸
发表于 2013-7-12 11:03 |只看该作者
挑取克隆就是用体视显微镜,但是你的显微镜是在相应超净台中的吗?如果不是,你就需要注意防止污染的问题了!
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
202 
威望
202  
包包
838  

优秀会员

地板
发表于 2013-7-18 19:57 |只看该作者
回复 nichifanlema2 的帖子
& U: o4 L% F. r5 ^& u# K) u1 g8 ^. F# @, M5 t3 K9 |. W
想在请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!

Rank: 2

积分
202 
威望
202  
包包
838  

优秀会员

7
发表于 2013-7-18 19:57 |只看该作者
回复 cn8867567 的帖子
) V6 Z$ b) l: T+ Y, o. R& Q  F' h& ]
想再请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!

Rank: 1

积分
19 
威望
19  
包包
72  
8
发表于 2013-8-11 01:39 |只看该作者
1- 贴壁第一天可以使用20%FBS,半量培养基,贴牢后再补加;
' Y2 U. K+ ~2 @  U0 Q2- EB球的数目,尽量多些吧,目测应该在100个以上才安全些。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 5 + 15 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 5  包包 + 15   查看全部评分

Rank: 1

积分
10 
威望
10  
包包
56  
9
发表于 2016-8-9 04:38 |只看该作者
回复 nichifanlema2 的帖子+ g+ y4 @3 ]& R1 X. H  q5 U
' c1 j/ ?( I  f) f; h7 W. f
您好,新手一枚,您说的这个方法是指把克隆吹打成小碎片,然后放在培养液里4-6天后即可自然形成EB吗?我最近在做用人ips细胞形成EB,方法是用EDTA消化掉滋养层细胞,然后收集ips细胞制成悬液,加到96孔板离心,原则上应该24小时后就可以形成EB了,但不知道为什么总是不成功,不知道您有无相关经验,请赐教,谢谢!
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 2 + 10 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 2  包包 + 10   查看全部评分

Rank: 2

积分
212 
威望
212  
包包
271  

优秀会员

10
发表于 2016-8-9 08:41 |只看该作者
回复 echoxy1020 的帖子/ U9 G, M6 |9 H+ I# U
' [, s' A( {. i& |! w) e. f& b
EDTA消化后的克隆非常小,甚至都会成为单细胞,这样细胞会非常容易死掉。另外,EB体外形成一般用悬浮培养,用96孔板稍麻烦一些,即使没有包被,也会贴壁,只是贴的很不牢,慢慢都死掉了。小克隆或者单细胞的悬液,悬浮培养做EB时,可以尝试加Y,或者商业化的EB形成培养基,价格没那么贵,效果会好很多。
已有 1 人评分威望 包包 收起 理由
细胞海洋 + 10 + 20 欢迎参与讨论

总评分: 威望 + 10  包包 + 20   查看全部评分

‹ 上一主题|下一主题
你需要登录后才可以回帖 登录 | 注册
验证问答 换一个

Archiver|干细胞之家 ( 吉ICP备2021004615号-3 )

GMT+8, 2025-6-2 10:59

Powered by Discuz! X1.5

© 2001-2010 Comsenz Inc.