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请教关于EB的形成与克隆的挑取 [复制链接]

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楼主
发表于 2013-6-5 16:16 |只看该作者 |倒序浏览 |打印
请教一下各位:. r/ [4 `1 e, a& I; d
1、如果用悬滴法形成EB的话,是使用纯的ES/iPS来进行的么?细胞量大概在多少呢?那MEF是如何消除干净的呢?
2 p: {+ E1 c. a# N/ n2、如果直接用悬浮法的话,就是把细胞消化下来直接接种到低附皿里就可以了么?是单细胞悬液么?MEF不需要清除么?
, p8 \5 C( t7 I& h# V3、还有在细胞克隆形成的时候,如果需要把克隆挑取出来,各位是用的什么设备呢?普通的体式显微镜能够看到么?还是需要什么特殊的配件才可以?
$ D. B5 p4 Q! s" z谢谢各位!

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沙发
发表于 2013-6-6 09:11 |只看该作者
直接消化后不必去除MEF,ES细胞会形成EB,MEF就直接分开了8 q5 Z3 }. y; O
如果要取出克隆,直接用10ul 的枪头就可以
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藤椅
发表于 2013-6-6 10:00 |只看该作者
回复 your1024 的帖子4 g+ I4 _/ v- ~) v0 c7 @
2 _  n0 K% F6 N) i( k/ [
悬滴法形成EB,理论上用纯的ES/iPS.细胞数500-1000个/20ul,MEF通过差速贴壁法去除.具体方法:胰酶把细胞消化成单个细胞,之后用分化培养液重悬细胞,在事先0.1%明胶包被过的小皿中差速培养1h,大部分MEF  细胞已经牢固贴壁,而ES/iPS还没有贴壁,收集上清获得较纯的ES/iPS,计数之后悬滴培养。) `' ]8 ~9 V& E
细胞克隆形成之后用10ul的枪头挑选,可事先在培养皿有克隆的部位划个圈,然后再挑出克隆。
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板凳
发表于 2013-6-6 23:09 |只看该作者
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回复 zpzp0312 的帖子
% G3 H; H# R6 U  T8 m
8 R2 V1 B. c8 o9 K5 J感谢回复!

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报纸
发表于 2013-6-6 23:10 |只看该作者
本帖最后由 your1024 于 2013-6-6 23:13 编辑
$ `# O1 q  I+ D" a* x2 R3 j, U# V0 k$ |5 w( l% {* q. V
回复 frankieisme 的帖子
% [7 R+ Y) D) u* Y9 ?$ m# v# U4 y2 Z) I; D
谢谢您的详尽回复!

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地板
发表于 2013-7-18 20:03 |只看该作者
回复 frankieisme 的帖子
- R) k4 g' \2 [! r2 i/ e4 M! [) s$ f/ ]0 n: c: z
想再请教一下,EB形成之后重新贴壁进行诱导培养的这个过程中有什么技巧么?我总是不能让EB很好的贴壁,要么是看着已经贴了,加液之后又重新悬浮起来;要么是放的时间长了,细胞都死了(本身带GFP的细胞,淬灭了),我用的孔板,事先用0.1%明胶铺了有几个小时。这个怎么解决呢?还想问下,如果做WB或者PCR的话,6孔板一个孔里面要有多少EB存活才好呢?谢谢!

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发表于 2013-7-19 23:13 |只看该作者
回复 your1024 的帖子
! l- J; I0 ?( V0 f. [5 N4 ~- m( F8 D5 [
0.1%明胶铺半个小时就差不多了。EB有点抱团的习性,尽可能把EB混匀。还有密度尽可能不要太大了,EB太多了不容易贴,容易散开,6孔板一孔种二、三十 个,大多数都能贴并能跳,我的经验。要做WB或PCR的话你只能多准备些板子。 一般第二天换液,不能贴的也就不要了,随后根据细胞状况每天或隔天换液。
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发表于 2013-7-20 17:30 |只看该作者
回复 frankieisme 的帖子8 r( M, C; Y2 f# Q/ G! S/ v

' c6 r) A* S; I) {7 P谢谢!我再实践一下。

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发表于 2013-9-27 14:28 |只看该作者
我们用悬滴法做EB,hESC 每滴1X10^4个细胞 20ul
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