PBMC没有分离出来

momoenn

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# c* v) ]: ^) ^) c' J0 g! K# c; G- q今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个核细胞。大侠们遇到过这种情况吗？在线等待。

Andyhigh

momoenn 发表于 2014-4-3 21:39 . z; J' V- V& ^7 Z
今天第一次做病人的外周血分离，无单个核细胞。外周血取得上肢静脉血，无动员，按程序操作，没有分离出单个 ...

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能分享下protocol不，大家讨论下看问题出在哪了，我对这方面比较感兴趣！
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首先上传一份我做小鼠脾脏淋巴细胞分离的方案，可能与你的不太一样：, E0 V8 W; U" S- R8 f
; g/ ~, X$ e2 K1 j( j9 [. }
一、        溶液配制
$ O. Q4 r! b: C! U1.  1.5M Nacl的配制：4.4g Nacl+50ml蒸馏水 充分溶解后过滤除菌。6 V3 Q- G5 T9 O3 P+ Q
2.  0.15M Nacl的配制：去5ml 的1.5M Nacl，加45ml的蒸馏水稀释( @$ V$ j* [/ y
3、100%Percoll (6ml)： 5.4 mlPercoll母液+0.6 ml 1.5M Nacl溶液& q& Z8 {& l- G' P; h6 p% m4 b
4、70% Percoll (6ml) :  4.2 ml100% Percoll+1.8 ml0.15M的Nacl 溶液。! u5 ?8 ~" Q7 \8 s6 |
6、40%Percoll (3 ml)   1.2 ml100% Percoll+1.8 ml 0.15M Nacl 溶液。3 @! C8 i% X# O
7、        红细胞裂解液：索莱宝R1010。: U+ X4 L. h- ?1 Z; _* @* X5 M6 K
8、        6~8周龄雌鼠
, H  H. \; l7 J  q5 }) g/ _) i. q& O9、        洗液：95% RPMI 1640+5% FBS +10 mM Hepes6 q( U' B( z1 e. Y
10、        增殖培养基：90% RPMI 1640+10% FBS +10 mM Hepes+双抗+2.5ug/ml ConA
% m1 O6 o, z# k二 . 小鼠淋巴细胞的获取：# o) {2 h. y9 C% J4 u# A
1、断颈处死小鼠，浸泡 于 75% 的乙醇中。* g5 G/ V$ x, ]9 h/ E. c9 Y) x
2、在超净台中取出小鼠脾脏，将脾脏在预冷的洗液中洗1遍。
# Y7 d3 g' A# F5 _9 t" }% l3、将脾脏转移至一个干净的6cm皿中，加入4ml预冷的洗液，皿放置于冰盒上，将10ml的注射器针头折弯成150度角。
! Q0 c# r9 v; m  m5 h' g4. 先用针头在脾脏上扎孔，再用镊子固定脾脏，用针头挤压脾脏，将其中的细胞释放出来。, L# ^" m) E* w" J8 u' z! J
5.. 将收集到的细胞悬液用200目的纱布过滤2次。9 ~! B& L3 a! ~9 t! O* b
6. 过滤后的悬液1500 rpm离心3min，弃去上清，用3 ml 40%的percoll 重悬待用。) N" j5 @& Q5 E1 r+ a( ~4 T
7. 取一个15ml的离心管，用1 ml的牛血清湿润试管壁，除去多余血清，再加入6m 70%的percoll。- @8 x3 l3 L' n  A7 _, B  J% M
8. 用巴斯德管吸取6中的细胞悬液，试管稍倾，在距离液面1cm处紧贴管壁任其自然慢慢流下，注意勿破坏分离层的界面。
6 I5 o: o0 a1 T* ^9.再吸取1 ml的洗液铺于40% 的percoll上层。$ |& C$ J8 m, n* d
10.将离心机的加速度调为0，在水平离心机上800g（我们的为2000rpm）室温（20度）离心20min。4 D" V- o  Z) Y
11.吸取40% percoll和70%percoll之间的细胞，加入5ml洗液，离心去上清。. \: Q. {2 V% u
12. 向细胞沉淀中加入3ml的红细胞裂解液，转移至6 cm皿中，冰盒上孵育4min，再加入6ml洗液稀释裂解液，1500 rpm 4度 离心3min，弃上清。
9 p6 m% {+ W" ]& W/ G( j$ \, \13. 用洗液洗涤2遍后，培养液重悬待用。8 \" ?5 s0 S2 G$ }' j' m
9 ]4 L5 U( w, ~9 ^4 W% R, w
4 U" F- g5 J- U

thor0504

回复 momoenn 的帖子' O+ V/ R+ p6 Q) G/ {/ [
, `1 h% P" E( `$ |4 `2 f8 Q# o
取血量是多少？按照什么程序操作的？用的什么方法分离的？密度梯度还是别的？

momoenn

回复 Andyhigh 的帖子) f& D  k4 b6 |2 ?

2 I( B( C3 w( O& ^- S我们用的是ficoll

momoenn

回复 thor0504 的帖子3 b1 J  a5 B3 u: e3 ?# [/ Y! \
$ Z* w6 x6 p. o5 \$ _
100ml，沉降加密度梯度离心

thor0504

回复 momoenn 的帖子% P! |6 p' [, W( r* h" N$ J8 Q% _

) O- P% V) [) w具体的步骤呢？每步的离心力、时间、ficoll的用量分别是多少？有先分离血浆吗？

heirrii

100ml外周血，应该能分很多啊

heirrii

血液先稀释没

levell

血液细胞用PBS稀释后加入到淋巴细胞分离液上，离心，注意离心加速度调到最低，很关键，不然起步和停止速度过快就会把液面打散了" v; l2 J  F3 m: r7 z- o3 `) @/ T

weijunning

回复 momoenn 的帖子& }0 ]1 |5 u' [7 r. a# P0 j& M

1 H$ W0 q: ]9 l2 K% C6 T请问这个病人是什么病人？如果是癌症患者，无动员直接从上肢静脉抽血，很难获得足够数量的PBMC，有的血象差的病人基本上分离不到白膜层。所以，建议还是先动员一下再采血比较好。