Taqman探针法——PCR体系的建立

xiaolong523

1、引物、探针的设计：& [7 z2 l& h0 e
      探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素，% Y0 U  r5 L) y* l5 L( B$ H. C0 Y
       引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
7 R. d. ?$ q* [! t  y% E! \: _- U( _* `1 m
2、反应参数的确定：
  G. I* H& Y# }+ u2 y       一般为：94 ℃，10-20S
, }6 @/ u1 m( j1 E                        60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通过温度梯度优化退火温度
# c/ v2 z  _  ?( {# b% Q! Q* d$ r6 g                     ( D0 {/ F/ |  B) v
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值
( [3 ]$ J% ?/ w- {! ^2 V+ E$ ]       引物浓度：50-900nM
2 p  i9 x7 M( S5 t$ m       探针浓度：50-250nM/ j; a# s  M# |. V

Tlexander

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