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发表于 2016-2-2 16:41 |只看该作者 |倒序浏览 |打印

新版起草人：lml 编号： SOP-001  h) {' s6 k5 ^. l
2016年外周血Car-T细胞培养标准操作流程页数：1/5
Car-T细胞培养标准操作流程
1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。2 h* r2 T/ Z8 m! r. v5 I1 b
2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养. {8 F. D; I! u( u# @5 \
3责任人：实验员人、临床相关人员  J3 z# A6 W( i$ l6 e" e
4 内容
4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管( r' R9 P1 Q5 g
4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。$ u5 v" e3 T' c( S+ W
4.3环境：
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在
百级生物安全柜内进行。3 V! K# v! d3 F
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间
不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。# D, v2 j+ r; }$ _. [4 J
4.4操作：
4.4.1采集接收外周血1 I! x! g7 X+ K+ T$ _) p
4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。) l) T7 p* C3 P* R9 o! @
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4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信
息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
4.4.2操作前准备% v  ^; N# |1 T6 S: v) u
4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安2 }2 \' I+ m+ W; w1 q# a
全柜运行稳定。# Y' |: S6 X' |  |, ]( x
4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。0 y. J6 {9 p7 y! |' i. _
4.4.3  分离单个核细胞（PBMC）：
4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋  C, Z; l" T) t7 Q$ m
内外周血转入50ml离心管中。
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。
4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min，慢升慢降。2 h1 L1 `9 R. m& F, v1 ~- W
4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处# T8 n  e" U3 {: }

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弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细
胞悬液体积比应大于1:3，混匀。: G8 a3 k; K2 I" m  m+ G- ~6 H+ o9 L/ p( r
4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。9 Y% Q5 p9 r' Z& G! d" h
4.4.4细胞培养：$ J9 m, B; {0 y! e) ^
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞
培养基PH值7.2-7.4。
4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)。混匀放入CO2培养箱培养2小时。' J  f$ c$ ?) ~& t3 f
4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。+ [$ y/ `7 K5 \  Z
4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。9 f2 e1 `1 R9 [& e( o" p  E/ L
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4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。' S  s( d) ~: f- ~( l+ H
4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
4.4.5 Car-T细胞收集：! B/ s+ b- D9 X$ A' }
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。  L8 q: ^( B& J+ E+ z* W
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。+ E3 A6 _- w; l# g1 U; ]
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。2 D! |+ `" w3 G0 S9 {
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细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：
4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。6 }2 Z8 [6 f# k" Q1 g& `0 \+ V
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。9 ?) }* ~' P* x. }& L6 V