Car-T操作流程

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新版        起草人：lml        编号： SOP-001
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1 目的：保证Car-T细胞制备和培养符合要求。
3 a) u/ v! r% r) A4 g' y  s* g. k) Z2 范围：适用于符合实验的要求患者外周血制备和培养0 W& f2 c6 ^+ o. x3 Z% U. D; y
3责任人：实验员人、临床相关人员
% l0 O. S# \6 ^5 U/ U4 内容
8 w5 z6 G+ u  V) D4.1耗材：50ml离心管，10ml移液管，5ml移液管，75cm2培养瓶，150 cm2培养瓶，EP管，1.8ml冻存管
" u. K! y4 Z, v7 @4.2试剂：X-VIVO 15TM，PBS缓冲液，75%医用酒精，人淋巴细胞分离液，CD3/CD28免疫磁珠，IL-2，注射用人血白蛋白。* D) g6 s$ s9 r- }% A, [
4.3环境：. D1 _! K* n$ s
4.3.1外周血分离，培养应在恒温恒湿的万级层流室内进行，开放操作必须在
2 D: A: q, T; S% ^3 j( k( t# ]$ j百级生物安全柜内进行。- a1 i8 `2 S/ O) C& b* h; m6 t2 J
4.3.2实验人员应提前对净化室和生物安全柜进行杀菌消毒，紫外线照射时间6 u8 |! E% X5 O% V4 `
不少于30min，消毒消毒后，净化空调开启时间不少于30min，生物安全柜运行稳定后方可操作。" [, J  G6 T7 p$ z$ k8 _. o
4.4操作：
8 l( d5 C- q/ c) U4.4.1采集接收外周血
! g0 Z/ A2 c* s, u* C/ @2 B) ` 4.4.1.1患者符合治疗方案，各项检测符合要求，采集患者外周血60-80ml。
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4.4.1.2接收外周血并填写《外周血采集交接记录》，核对外周血患者相关信! b$ m) D% K" m! C0 }8 e1 m7 E
息，及相应检测报告，报告由医院提供，至少包括：HBsAg，HCVAb，HIVAb，Anti-TP，ALT。
1 `6 Y: f; X' p8 M9 t& \4.4.2操作前准备
* t" Q8 A, Z2 j. t4.4.2.1净化室，生物安全柜消毒完毕后，开启净化空调运行30min，生物安2 Q* j$ r! U  Q5 d1 u8 W! O
全柜运行稳定。
% H8 i5 \3 i2 m* e  K$ h4.4.2.2从试剂间冰箱中取出细胞培养基，恢复室温。
; \- u1 Z- z: S& M4.4.2.3生物安全柜表面75%酒精消毒，外周血袋表面酒精消毒转入安全柜内。
- L. W( M6 l: F; J4.4.3  分离单个核细胞（PBMC）：
4 s, j! ^" t7 t  ]5 Z, E! d* g4.4.3.1使用灭菌消毒的剪刀剪断血袋塑料管或者使用一次性注射器，把血袋* m* ]6 O; |: t
内外周血转入50ml离心管中。$ O1 N# f& `7 q4 ~
4.4.3.2用PBS缓冲液按1:1稀释外周血，混匀。; K( W, n. Z  y" T! P" n7 F# ^: G
4.4.3.3将稀释好的血样缓慢加入室温的15ml人淋巴细胞分离液的离心管中。方法如下：用10ml移液管吸取血样，伸至分离液液面上方0.5cm处，血样自然滑落铺至分离液面上，然后轻轻加入血样，注意不要冲破液面。6 s$ N6 v+ o/ M, Z1 _& ^. w
4.4.3.4配平离心1200g(2100r/min)离心20min，慢升慢降。
. x! j7 y& F+ h. p6 n) a5 ?4.4.3.5离心完成后，离心管出现明显分层由下至上：红细胞层，粒细胞层，Ficoll层，单个核细胞层和血浆层。吸取血浆层至距白膜层5mm左右处
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+ P3 B+ u- T8 v弃之。小心吸取红细胞层以上的所有液体至离心管中，PBS稀释，与细) z2 L' d  m9 K0 a* S
胞悬   液体积比应大于1:3，混匀。
7 G9 C! |% B- Y4.4.3.6离心600g（1600r/min）5min，PBS重悬细胞混匀，取少量细胞计数。/ j! ]8 E2 m/ [3 \
4.4.3.7离心300g（1200r/min）5min，上清液送检无菌检测。
6 F  T' }( I" u6 ?) b; y# Y4.4.4细胞培养：6 [/ S8 b# r: f8 }/ S
4.4.4.1细胞培养条件：恒温37℃，CO2浓度 5%，相对饱和湿度95%，细胞
( X) X6 Q5 E- b2 m. p' s培养基PH值7.2-7.4。
% [6 a& T$ z/ C1 |, W( q0 g# ], @4.4.4.2根据细胞计数调密度2x106/ml加入培养瓶中(T150 200x106/100ml, T75 100x106/50ml ,T25 50x106/25ml)。混匀放入CO2培养箱培养2小时。
6 P7 G. |9 G- L- Y  l4.4.4.3取出培养瓶，轻摇，使沉降于底部的悬浮细胞浮起，培养瓶倾斜30度角，移液管吸取培养基转入离心管中，少些培养基洗培养瓶将悬浮细胞全部收集，混匀计数。
& f9 J; Z1 p! U$ q* ^4.4.4.4根据细胞计数调整细胞浓度1.2x106/ml接种培养瓶中(100-120ml in a T150，50-60ml in a T75，15-29ml in a T25)，加CD3/CD28磁珠，按细胞与磁珠比例为1:3（加之前磁珠用培养基洗涤3次，去除保存液），加入IL-2 100U/ml，混匀放入CO2培养箱培养。
( y$ i: O; {- t2 ?& w/ l6 U4.4.4.5次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。
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" O$ _$ }5 N' ^% @4.4.4.6细胞培养3天，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
# F1 Z+ f; k! k+ }$ V4.4.4.7细胞培养5天去磁珠，细胞混匀转离心管中，在磁力架上去除磁珠，细胞计数补加培养基，IL-2  100U/ml细胞密度调整至0.6x106/ml继续培养。
/ A" r& @, V! s2 k2 n- e- h4.4.4.8定期观察细胞生长情况，主要观察其形态的变化，数目及增值情况，细胞碎片及杂质情况，每2-3天加液培养。& h1 s3 \  x+ S8 I
4.4.4.9根据细胞状态和临床治疗需要，培养9天时细胞数量达到要求，各项检测合格。包括：无菌检测，内毒素检测，细胞活力，细胞表型等。
: H9 {; ?! Y" f* C4.4.5 Car-T细胞收集：% Z7 U- g9 z' v0 K$ f" a
4.4.5.1确认细胞各项检测己符合要求。: |9 T4 g9 E  A
4.4.5.2根据治疗方案（一般一个疗程分多次回输，间隔时间为1天），取出相应细胞悬液，剩余细胞补加培养基继续培养，供再次回输。6 U+ g; \: ~5 C* E: N( t- t
4.4.5.3细胞悬液转入离心管中，300g离心5min。0 E% ^' i- @& a( g. }9 m  C/ Y
4.4.5.4除去上清培养液，加PBS缓冲液稀释混匀，300g离心5min，弃上清，PBS缓冲液300g/min离心5min。% q5 m, [4 n* D2 x
4.4.5.5细胞装袋（一般静脉回输，采用100ml双阀盐水袋），离心完成后取上清，做无菌检测，20ml生理盐水重悬细胞，100μm细胞滤网过滤，取少量细胞悬液进行细胞数量，细胞活率，革兰氏检测，内毒素检测。* j7 D. A6 D+ t& Y" P
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5 N- W1 Y; x2 `7 p/ d3 c9 h细胞过滤完成，转入100ml盐水袋中，加5%注射用人血白蛋白，贴上标签，并填写相关记录。4.5细胞运输与保存：
  }! O- C( Y/ J1 F 4.5.1核对细胞标签内容，填写回输发放记录。6 v. x1 [: K$ j6 C0 o
4.5.2细胞盐水袋放置于运输容器内（一般为疫苗箱，4度），填写交接记录表。
) D2 q8 H% s6 v. e4.5.3运输人员在运输过程中避免距离震荡，并在规定时间内送到。8 w- c: b" J! L# l, C
4.5.4细胞运输保存温度保持在4度左右，并在规定时间内回输，如果患者不能按时回输，请及时联系实验技术人员，返回实验室。" e- s5 ?( |8 s$ V. d4 P7 N/ c/ K3 _
) p$ ]. B: z! v: \) f7 l. n( t

3 [& b3 b& C" k4 `9 Z

yooung

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我的小宝贝

谢谢分享！

吕小松

这是car-T么？转染在哪儿？

biluolinyu

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1 R; `! ~+ H5 d9 ]6 J8 O
在   4.4.4.5 里面写的 + ~8 B* |; e/ Y& \! t: K# {
次日细胞培养1天，调整细胞密度至0.6x106/ml，加入病毒（MOI为1-5）混匀放入CO2培养箱培养。

a276038921

感觉不像啊

苹果树

为什么没有测转染率呢？怎么知道病毒就转进去了呢

swtarron

怎么感觉不像啊

easyess89

我们医院现在做的是DC-CIK，治疗效果个体差异比较大，CAR-T貌似更高级些，它的治疗效果如何？

ET生物人

不用筛选Tcell？？病毒感染一次就可以？感染率是多少？